吸附精制白喉类毒素制造及检定规程

　　本品系精制白喉类毒素经氢氧化铝吸附制成。用于预防白喉。

　　1 毒素制造

　　1.1菌种

　　1.1.1 应选用中国药品生物制品检定所分发或同意的白喉杆菌PW8株，或经由PW8株筛选的产毒高、免疫力强的菌种。必要时可对菌种进行筛选。

　　1.1.2 菌种宜用冻干法保存。亦可用血清斜面或产毒培养基传代保存，但代数不宜过多。

　　1.2 培养基

　　宜用胰酶牛肉消化液培养基或其他适宜培养基，但不得采用马肉或其他马体组织，应尽量减少对人体引起过敏反应的物质，不应含有可以引起人体毒性反应的物质。

　　1.3 毒素

　　1.3.1 毒素制造过程应严格控制杂菌污染。凡经镜检或纯菌试验发现污染者应废弃。

　　1.3.2 用于生产的毒素效价不得低于150Lf/ml。

　　1.3.3培养物加甲醛溶液或甲苯杀菌后进行精制或过滤后进行脱毒。所用化学原料应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》。

　　2 精制

　　2.1毒素或类毒素可采用硫酸铵活性炭二段盐析法或其他适宜方法精制。

　　2.2用于精制的毒素或类毒素可多批混合，但不得超过5批。

　　2.3精制过程应避免染菌，透析过程可加适量防腐剂，有肉眼可见染菌者应废弃。

　　2.4 化学原料等级应不低于化学纯。

　　2.5用同一菌种、培养基处方、精制方法制造的类毒素在同一容器内混合均匀后除菌过滤者为1批。除菌不彻底者可重滤。

　　3 类毒素制造

　　3.1制造过程应减少污染机会，如有肉眼可见染菌应予废弃。

　　3.2 毒素或精制毒素中加入适量的甲醛溶液，置适宜温度进行脱毒。精制毒素亦可加适量赖氨酸后再加甲醛脱毒。所用化学原科等级不应低于化学纯。

　　3.3 脱毒试验

　　每瓶类毒素或精制类毒素取样，用灭菌生理盐水分别稀释至100Lf/ml，用体重2.0kg左右的家兔2只，每只动物分别皮内注射上述稀释样品各0.1ml及25倍稀释的锡克毒素0.1ml,于96小时判定结果。样品注射部位须无反应或仅有几无可量的反应，锡克反应须为阳性。

　　3.4 脱毒不完全者可继续脱毒，必要时可补加适量甲醛溶液。

　　3.5 用于生产的类毒素效价不应低于100Lf/ml。

　　3.6 毒性逆转试验

　　每瓶精制类毒素取样，用pH7.0～7.4磷酸盐缓冲盐水分别稀释至30～50Lf/ml，置37℃20～30天，用体重2.0kg左右的家兔2只，每只家兔分别皮内注射上述稀释样品各0.1ml及25倍稀释的锡克毒素0.1ml，于72小时判定结果。样品注射部位红肿反应直径不应超过15mm，锡克反应须为阳性。

　　3.7 精制类毒素应加0.01%(g/ml)硫柳汞为防腐剂，毒素精制法制造的精制类毒素未除游离甲醛者可免加防腐剂。

　　3.8 类毒素保存于2～8℃，自脱毒合格之日起不得超过3年。

　　4 精制类毒素检定和保存

　　4.1pH应为6.4～7.4

　　4.2 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行

　　4.3 纯度

　　应不低于1500Lf/mgPN。

　　4.4 安全试验

　　用生理盐水将各亚批等量混合的精制类毒素稀释成50Lf/ml，用体重300～400g豚鼠4只，每只腹侧皮下注射5ml，观察30天。前5日注意观察注射局部，第10、20、30天称取体重。观察期间每只动物体重不得持续下降，到期每只动物体重应比注射前增加，注射局部无坏死，无连片脱皮、脱毛。后期不得有麻痹症状。

　　4.5 效力试验

　　将各亚批等量混合的精制类毒素稀释成35Lf/ml，用体重270～350g健康豚鼠5只，每只皮下注射0.5ml，第30天各攻击10MLD白喉毒素。用于配制含有百日咳菌苗的制品，可按成品比例与百日咳菌苗配成小量二联制剂样品，免疫方法与剂量同上，第30天各皮下攻击50MLD白喉毒素。二种攻毒均观察7日，攻击后动物死亡数不得超过20%。同时另用体重240～270g健康豚鼠3只，各皮下攻击1MLD白喉毒素作对照，其中2只应在96小时内死亡，允许1只晚死或发病。

　　4.6 保存与效期

　　保存于2～8℃。自精制之日起效期为3年半。

　　5 吸附剂的配制

　　见《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中5项。

　　6 吸附精制类毒素的制造

　　6.1吸附制品应含精制白喉类毒素30～50Lf/ml。

　　6.2氢氧化铝用量不得超过3mg/ml。

　　6.3 吸附制品应加0.005%～0.01%（g/ml）硫柳汞为防腐剂。

　　6.4 同批精制类毒素及同批吸附剂吸附的制品为1批。用大罐吸附者每罐为1批，所用精制类毒素及吸附剂可多批混合，但各不得超过3批。

　　7 成品检定

　　7.1理化性状

　　7.1.1 吸附精制白喉类毒素振荡后应为乳白色均匀悬液，无摇不散的凝块或异物。

　　7.1.2pH值应为6.0～7.0。

　　7.1.3 氢氧化铝含量不应超过3mg/ml。

　　7.1.4 氯化钠含量为0.75%～0.9%（g/ml）。

　　7.1.5硫柳汞含量不应超过0.01%（g/ml）。

　　7.1.6 游离甲醛含量不应超过0.02%（g/ml）。

　　7.2 无菌试验

　　按《生物制品无菌试验规程》进行。

　　7.3 安全试验

　　每亚批取样等量混合，用体重300～400g健康豚鼠4只，每只腹侧皮下注射2.5ml，观察30天，注射部位可有浸润，经5～10天变成硬结，30天可吸收不完全，在第10、20、30天称体重，到期每只动物体重比注射前增加，豚鼠无晚期麻痹者评为合格。

　　7.4 效力试验

　　每亚批取样等量混合，用体重300～350g健康豚鼠5只，每只皮下注射0.1ml，第30天各皮下攻击200MLD白喉毒素，观察7日，攻毒后动物死亡数不应超过20%。同时另用体重240～270g健康豚鼠3只，各皮下攻击1MLD白喉毒素作对照，其中2只应在96小时内死亡，允许1只晚死或发病。

　　亦可按WHO推荐的效力试验方法（见附录）进行。

　　7.5 稳定性试验

　　生产工艺有改变时应做稳定性试验。抽三批不同批号的精制类毒素配制的成品，保存于2～8℃，在效期结束之日进行效力检定，应符合规程要求。

　　7.6 鉴别试验

　　抽取样品加构橼酸钠将吸附剂溶解后作絮状试验，或将样品调pH至9.0作凝胶免疫沉淀试验，以出现絮状反应或免疫沉淀反应者为合格。

　　8 保存与效期

　　保存于2～8℃。自吸附之日起效期为3年。

　　附录WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法

　　可选用以下两种方法之一种进行。

（一）Vero细胞测定抗体法

　　1 免疫与采血

　　用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品以2倍稀释法稀释成3～5个适当稀释度，每一稀释度样品免疫体重10～14g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周后，每个小白鼠采血，分离血清，56℃30分钟灭活，放-20℃保存。

　　2 毒素试验量测定

　　Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素试验量采用Lcd/10000。

　　在96孔培养板中用RPMI1640（或199）培养液将毒素做2倍系列稀释，每孔50μl，然后向各孔中加入50μl标准白喉抗毒素（0.0001IU），用胶带密封，在室温放置1小时后，加入50μlVero细胞悬液（见3项）密封，放37℃CO2孵箱培养6～7天后，观察结果，使细胞死亡的最大毒素稀释度孔（红色）就是Lcd/10000。

　　Lcd/10000的毒素量约相当于1×10^-4Lf的毒素适用于本试验。

　　3 Vero细胞

　　RPMI1640（或199）培养液（加青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，胎牛血清10%）。Vero细胞培养于150cm²培养瓶中，待细胞长成占瓶底80%～100%单层时，弃去上层培养液，加10ml0.25%胰酶，放37℃数分钟，弃去胰酶，加入10ml培养液，打匀细胞进行计数（1瓶150cm²培养瓶大约可得10～40×10⁶细胞）。用培养液调整细胞浓度至2.5×10⁵细胞/ml。

　　4 阳性对照小白鼠血清

　　用吸附白喉类毒素免疫1批小白鼠，免疫5周后采血，分离血清，分装小管，冷冻干燥，保存于-20℃。

　　5 抗体滴定

　　按下图将培养板编号：

　　A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

　　B1

　　C1

　　D1

　　E1

　　F1

　　G1

　　H1

　　（1）向每孔加入50μl培养液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100μl培养液。

　　（2）取8份待检血清，分别加入A1至H1孔各50μl，横向进行2倍系列稀释，直至A10和H10孔。

　　（3）将标准白喉抗毒素稀释至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50μl，从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。

　　（4）H11和H12孔加入阳性小白鼠对照血清50μl。

　　（5）除G11和G12孔外，向其余各孔中加入毒素（Ldc/10000）50μl，轻轻转动培养板，混匀，在培养板上贴上胶带将板孔封闭，放室温1小时。

　　（6）收集Vero细胞，进行计数，并稀释成2.5×细胞/ml的Vero细胞悬液。

　　（7）室温放置1小时之培养板，去胶带，立即加入50μlVero细胞悬液，再用胶带封闭培养板，放37℃CO2孵箱培养6天。在24小时及48小时检查胶带封闭情况，如出现封闭不严应更换。

　　（8）培养6天后取出培养板，根据培养液颜色变化记录结果，黄色为（+），红色为（-），羲色不明显者则可用显微镜观察，如单层细胞完整无损则为（+），否则记录（-）。最终结果以打分表示，即变成黄色的最高稀释度孔的2的指数，例如：变黄的最后一孔是1/256即2⁸，则结果记为8。

　　6 试验要求

　　E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度都出现（-），如果出现（+），则毒素量和细胞敏感度都很低，应重试。

　　细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12必须是（+），如出现（-），应重视。

　　Lcd/10000毒素量的准确性，根据以上计划下列各孔中所加标准抗毒素为：

　　孔A11和A120.0004IU

　　B11和B120.0002IU

　　C11和C120.0001IU

　　D11和D120.00005IU

　　如毒素用量准确（Lcd/10000），则A11、A12和B11、B12孔应为（+），而C11、C12和D11、D12应为（-），否则应重试。

　　7 结果计算

　　用平行线分析法进行结果计算

　　8 结果判定

　　待检样品的效价每剂量应不少30IU。如95%可信限大于50%～200%，则95%可信限的低限效价应大于30IU/1个人用剂量。

（二）豚鼠毒素攻击法

　　1 免疫及攻击

　　用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品稀释成等比间隔的3～5个稀释度（中间的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物），每一稀释度样品免疫体重250～300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作为对照。免疫后4周，每只免疫豚鼠攻击白喉毒素100LD₅₀，皮下注射1.0ml。对照组健康动物注射100倍稀释之上述毒素，每只皮下注射1.0ml。攻击毒素后观察5日，每日记录结果。

　　2 试验成立应具备的条件

　　（1）检品的最低稀释度能保护半数以上动物。

　　（2）检品的最高稀释度保护半数以下动物。

　　（3）对照组动物应部分死亡而不全部死亡。

　　（4）检品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上没有太大的偏差。

　　3 结果计算及结果判定

　　见Vero细胞法7和8项。

吸附精制白喉类毒素使用说明书

　　本品系精制白喉类毒素经氢氧化铝吸附制成。用于预防白喉。

　　本品为乳白色均匀混悬液，含防腐剂硫柳汞，长时间放置后吸附剂下沉，溶液上层应澄明无色，但经振摇后能均匀分散。

　　接种对象

　　主要为6个月～12周岁儿童。

　　用法

　　1.上臂三角肌肌内注射。

　　2.剂量如下：

　　禁忌

　　患严重疾病、发热或有过敏史者及注射白喉类毒素后发生神经系统反应者应禁用。

　　反应

　　注射本品局部可有红肿、疼痛、发痒，或有低热、疲倦、头痛等，一般不需处理即行消退。

　　注意事项

　　1.使用时应充分摇匀，如出现摇不散之凝块、异物，安瓿有裂纹，制品曾经冻结，标签不清及过期失效者均不可使用。

　　2.注射后局部可能有硬结，1～2个月即可吸收，注射第2针时应换另侧部位。

　　3.应备1∶1000肾上腺素，供偶有发生休克时急救用。

　　保存

　　保存于2～8℃暗处，不可冻结。