基因芯片在临床应用中的前景
中华基因网技术部 王嘉嘉
基因芯片及其技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新科技，一旦被广泛应用与临床，它将在一些重症传染病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、神经性疾病等方面，发生巨大的革命性的变革，基因技术在疾病的诊断、检测及治疗用药等方面有广阔的应用、研究价值。
一、基本概念
基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息[1]。基因芯片技术具有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，近年来在临床诊断、药物筛选、指导临床用药及治疗等研究领域带来革新性的影响。
二、基因芯片的主要类型
基因芯片的类型按分类方法不同可分为不同的类型[2]
1、无机片基和有机合成物片基的基因芯片
以基因芯片的片基或支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。
2、原位合成和预先合成然后点样的基因芯片
以探针阵列的形式分为原位合成与预先合成然后点样两种。芯片制备的原理是利用照相平板印刷技术将探针排列的序列即阵列图"印"到支持物上，在这些阵列点上结合上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术，该技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透的结果。预先合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA 合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的玻片上。
3、基因表达芯片和DNA测序芯片
根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因表达芯片可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同的个体(正常人与患者)、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA 测序芯片则是基于杂交测序发展起来的。其原理是，任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成 一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列(subsequence)，假如我们能把原序列所有这些错落重叠的亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序列。
另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列(或cDNA微阵列芯片)和寡核苷酸阵列(或芯片)，根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片(Toxchip)、病毒检测芯片(如肝炎病毒检测芯片)、P53基因检测芯片等。
又可以按生物化学反应过程分：
通常的生物化学反应过程包括三步，即样品的制备，生化反应、结果的检测和分析。可将这三步不同步骤集成为不同用途的生物芯片，所以据此可将生物芯片分为不同的类型。例如用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。
三、临床上的应用前景
1、疾病诊断
基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从"系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为'第二阶段医学'）"转变到"DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）"上了解疾病的发生、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。众所周知，肿瘤和遗传疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变，检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。目前，Affymetrix公司已开发出P53基因芯片，是将已知P53基因全长序列和已知突变的探针固定在芯片上，这将有助于恶性肿瘤的早期诊断。华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化[3]，他们将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库，另外还有342个来自EST克隆，包括一些已知确定的管家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9(GenBank录入号：M38690)、Epithelial glycoprotein (GenBank录入号：M32306)、P27（GenBank录入号：X67325）等，这证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性。又如，Hacia等［4］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104个长度为20 nt的寡核苷酸探针，用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(1～5 bp)突变。在15例患者样品中，发现有14例有基因突变，类型包括点突变、插入及缺失等；在20例对照样品中均未检出假阳性结果。又如，Heller等[5]采用基因表达谱芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性，发现已知炎症相关基因，如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症相关基因的表达，如人基质金属弹性蛋白酶(human matrix metallo-elastase)和黑素瘤生长刺激因子(melanoma growth stimulatory factor)。同时，与一个来自外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状态基因差异表达的比较，发现在类风湿关节炎组织中金属蛋白酶组织抑制物1，铁蛋白轻链和锰超氧化物歧化酶表达明显升高 。通过该研究，确定了许多基因与这两种病变的关系，为探讨基因芯片在诊断感染性疾病方面提供了新的思路。现在，肝炎病毒检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等多种芯片已面市，相信不久的将来，会有更多的基因芯片用于临床。
2、药物筛选
芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性，能够从基因水平解释药物的作用机理，可以用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用。例如，Kapp U等[6]用包含950个基因探针的基因芯片比较何杰金氏病细胞系L428及KMH2与EB病的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达谱，发现何杰金氏病源的细胞系中白细胞介素-13（IL-13）及白细胞介素-5（IL-5）表达异常增高，用IL-13抗体处理何杰金氏病院源细胞系可显著抑制其增殖，此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进何杰金氏相关细胞增殖,IL-13及其信号传导途径可能成为何杰金氏病治疗及药物筛选的新靶点。芯片用于大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，这可大大节省新药开发经费，并且可对由于不良反应而放弃的药物进行重新评价，选取可适用的患者群，实现个性化治疗。Michael Wilson 等[7]使用包含有肺结核杆菌基因组PRF的97%的序列的基因芯片，对应用抗结核杆菌药物异烟肼诱导前后表达的变化，结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、FbpC、efpA、fadE23、fadE24和 基因发生改变与耐药性有关，并为新药物作用的靶目标研究及指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成提供指导。研究各种药物对不同基因的作用，从而在剂量和成分搭配上做到精确无误。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌基因型，使得药品更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目的。
3、指导用药及治疗方案
种族、个体等因素都会导致遗传背景的差异，临床上，同样剂量的药物对于不同患者在药物疗效与副作用方面会有很大差异，如果利用基因芯片技术对患者进行诊断再开处方，就可以对患者实施个体化治疗。疾病一般不是由单个基因引起的， 在治疗中很多同种疾病的具体病因是因人而异的，所以用药也因人而异，例如，现用于治疗ADIS的药物[8]主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12个月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变，对药物的耐受能力成倍增加，如果将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测患者是哪些基因发生突变，从而可对症施药，指导临床治疗和预后。传统的中医药讲究的是整体治疗观，在中药基因组学和中药化学组学中，多成分、多靶点治疗是基点，关键就是分析出成分谱与活性谱，实现精确筛选和配置，?quot;复方"的形式作用于致病基因组。
4、预防医学
在婴儿出生前，可用生物芯片进行有效的产前筛查和诊断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。而在婴儿出生后，即可采用基因芯片技术来分析其基因图谱，不仅可预测出他日后可以长多高，还可预测其患某些疾病的潜在可能性有多大，以便采取预防措施。
四、前景展望
尽管基因芯片发展时间不长，迄今在医学研究实际应用中的例子还不多，但由于芯片技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对样品的需要量非常少，效率高，能高通量检测DNA序列，更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点，基因芯片在医学上的应用前景无疑是非常广阔的。但目前基因芯片还处在研究阶段，要成为临床可以普遍采用的技术仍有一些问题急待解决，随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。
参考文献
1. Stipp D. Gene chip breakthrough［J］. Fortune,1997, 31(3): 56-73.
2. ZHANG Tian-Bao Gene chip and its significance in medical research. Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 91-94，98
3. Wang K, Gan, L,Jeffery E, et al. Gene,1999,229(1-2):101～108
4. Hacia JG, Brody LC, Chee MS, et al. Detection of heterozygous mutation in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-color fluorescence analysis［J］. Nat Genet, 1996, 14(4): 441-447.
5. Heller RA, Schena M, Chai A, et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarray［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(6): 2150-2155.
6. Kapp U,Yeh WC,Patterson B,et al,Interleukin 13 is secreted by and atimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells.J Exp Med 1999 Jun 21;189(12):1939-46
7. Michael W,Joseph D,et al. Exploring drug-insuced alterations in gene express in My cobacterium tuberculosis by microarray hybridization, Issue 22, 12833-12838,October 26,1999
8. Lipshutz D, Morris D, Chee M et al. Using oligonucleotide pribe array to access genetic diversity. Biotechniques,1995,19(3):422-447