《动脉粥样硬化》 > 第十八章　血清载脂蛋白的免疫测定

第五节　免疫透行射比浊法

一、原理

当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH为6.5～8.0之间为宜。载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。

抗原抗体反应曲线

图18-4 抗原抗体反应曲线

在免疫比浊过程中，由于抗原抗体结合的三过程，从而导致光密度与浓度之间不呈线性关系，一般是3次方程曲线关系。若将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过3次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算，免疫比浊中，采用终点法或速率法，用5个或7个不同梯度进行定标，经3次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与光密度的关系曲线方程，才能作为定量的工作曲线。

二、血清ApoAⅠ（B100）透射比浊测定法

脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B₁₀₀）的定量测定。

（一）手工操作

1．原理

血清ApoAⅠ（B₁₀₀）+抗人ApoAⅠ（B₁₀₀）→抗原抗体复合物→测定光密度

2．试剂（伊利康）

（1）Apo缓冲液（RⅠ），含4%PEG6000和表面活性剂

（2）羊抗人ApoAⅠ（B₁₀₀）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。

（3）ApoAⅠ（B₁₀₀）参考血清（RⅢ）

3．操作

（1）按ApoAⅠ抗血清液或ApoB₁₀₀抗血清100μl，加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂（Apo抗体液）。最好临用前配制当天用量。

（2）各试剂用量如下表

	ApoAⅠ			ApoB₁₀₀
	标准管	测定管	空白管	标准管	测定管	空白管
参考血清	5μl			5μl
待测血清		5μl			5μl
ApoAⅠ抗体液	1.0ml	1.0ml	1.0ml
ApoB₁₀₀抗体液				1.0ml	1.0ml	1.0ml

混匀各管，37℃保温10min，波长340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。

（3）定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点（3～9点），按y=a+bx+cx²+dx³的3次方程回归曲线进行定标，制作参考工作曲线。

①校正工作曲线的绘制：

配制抗血清稀释工作液：按RⅠ试剂0.9ml，加RⅡ试剂100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。

制备5点校正液：取RⅢ（参考血清），用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度，第5管为原参考血清浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。

表18-20 标准曲线制备的各管（点）浓度

管号	1	2	3	4	5
1号管（0）（μl）	5
2号管（1/8）（μl）		5
3号管（1/4）（μl）			5
4号管（1/2）（μl）				5
5号管（1/1）（μl）					5
Apo抗体液（ml）	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0

混匀各管，置37℃水浴保温10min，按程序上机作工作曲线。

②标本测定：吸待测血清（测定管）5μl，加上述稀释抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保温10min，上机读数，打印结果。

③如测定值超过工作曲线上限值，仪器会打印显示“过高”，此时，将待测标本稀释1倍再测。

④每批号的抗血清应作一次多点定标，即测定标本的抗血清应与定标的抗血清是同一批号抗血清。

（二）生化分析仪测定

1．原理

脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B₁₀₀）的定量测定。

ApoAⅠ（B₁₀₀）+抗人ApoAⅠ（B₁₀₀）→抗原抗体复合物→测定吸光光密度

2．双试剂单（双）波长法

（1）试剂（温州伊利康）

RⅠ：Apo缓冲液，含4% PEG6000和表面活性。

RⅡ：羊抗人ApoA（B₁₀₀）稀释抗血清

RⅢ：Apo定值血清

（2）各试剂及标本用量如下表：

项目

血清

Apo缓冲液

（RⅠ）

ApoAⅠ抗血清液

（RⅡ）

ApoB₁₀₀抗血清液

（RⅡ）

ApoAⅠ

2～5μl

300～350μl

80～100μl

ApoB₁₀₀

2～5μl

300～350μl

80-100μl

（3）定标：以5点Apo梯度浓度，采用免疫定标法按表18-21参数上机定标，如图18-5所示。

ApoAⅠ 五点免疫定标曲线图

图18-5 ApoAⅠ 五点免疫定标曲线图（以CL-7200仪器为例）

（4）上机（终点法或两点法）

（5）说明：①Apo测定的光密度从340～700nm范围都可采用，多用340nm；②国内已有的Apo试剂盒均无需处理；③血清标本也无需处理，均可直接检测；④本法适用于多种类型的全自动生化分析仪检测，自动扣除空白，快速准确；⑤效价不同的抗血清，其用量应作适当的调整。

(5)计算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定标自动运算。

3.单一试剂单波长法

(1)试剂同双试剂法

(2)标本及试剂用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相应的Apo缓冲液(RⅠ)0.3ml的比例混合成单一试剂(Apo抗体液)。最好临用前配制当天用量,此抗体液置2～8℃保存一周有效。

（3）定标：按五点梯度稀释定值血清（见表18-21），以终点法或两点法进行免疫定标。

（4）按以下步骤操作：

（5）以△A=A2-A1值按免疫定标自动运算。

（6）说明：①该法一般用半自动生化分析仪；②通过设延迟时间以扣除空白；③RⅠ、RⅡ试剂以临用时混合为好，未用完的混合试剂应置于2～8℃冰箱保存，只允许使用一周；④血清标本无需再处理。

4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自动生化分析仪检测的有关数据。

（1）上机参数（以CL-7200型为例）如表18-21所示。

表18-21 自动生化分析仪检测Apo有关参数

	ApoAⅠ	AⅡ	B	CⅡ	CⅢ	E
反应类型	终点法
样品量	3μl	3μl	3μl	8μl	3μl	5μl
测量波长	600nm（第一）	数据	数据	700nm	700nm	700nm
700nm（第二）	数据	数据	340nm	340nm	340nm
反应时间	第一波长5min	数据	数据	数据	数据	数据
第二波长4.99min	数据	数据	数据	数据	数据
试剂Ⅰ	350μl	290μl	350μl	300μl	290μl	350μl
试剂Ⅱ	100μl	75μl	100μl	50μl	75μl	50μl
单位	g/L	g/L	g/L	mg/dl	mg/dl	mg/dl
标准浓度点数	5	5	5	5	5	5

（2）标准曲线制备参数如表18-22所示。

表18-22 生化分析仪检测Apo的定标浓度

标准管号	1	2	3	4	5	6
稀释倍数	0	1：2	1：4	1：8	1：16	0
ApoAⅠ度数(g/L)	172	86	43	21.5	10.8	0
ApoAⅡ度数(g/L)	36	18	9	4.5	2.25	0
ApoB浓度(g/L)	180	91	45.5	22.6	11.3	0
ApoCⅡ浓度(mg/dl)	4	2	1	0.5	0.25	0
ApoCⅢ浓度(mg/dl)	5	2.5	1.25	0.63	0.31	0
ApoE浓度(mg/dl)	10	5	2.5	1.25	0.625	0

5．单一试剂和双试剂检测方法的比较

单一试剂和双试剂在全自动生化分析仪测定的光密度变化过程，如图18-6所示。

从理论上考虑任何一种生化测定方法的试剂，临用时混合最好，可以消除试剂各种成份的自身化学变化和相互影响。而在实际工作中，是不可能的，只能是将几种不会起化学反应而又无相互影响的试剂配制成2～4种，临用时按一定比例配制使用。临床化学试剂盒，目前主要以1或2种试剂形式供医学检验使用，即单一试剂和双试剂两种形式。

笔者认为双试剂比单一试剂好，尤其是含酶试剂和免疫试剂以双试剂包装形式为好，有利于对酶的活性或抗体效价的保存。单一试剂是所有试剂混合在一起，存放过程中，有可能因化学物质的存在而损害试剂中的工具酶或抗体，存放时间越长，损害可能性越大，然而双试剂不存在这一问题。

对脂质的测定双试剂法更显其优越性，因为血清中脂质与载脂蛋白是以脂蛋白的形式存在，当测定试剂与血清标本混合后，首先解联脂蛋白，让其释放出脂质和载脂蛋白，。作为免疫测定试剂还兼有使载脂蛋白抗原决定簇暴露的作用。当R1试剂作用完后，加进第二试剂（R2）后，使其抗体适应抗原决定簇的要求，达到抗原抗体结构呈完全的互补状态，从而产生最大的抗原抗体结合量，达到定量的目的。双试剂测定法，既能自动扣去空白，又能使化学反应快速进行，从而迅速地完成检测的全过程。

单双试剂法反应过程的光密度变化曲线图