第二节　DNA的序列测定

核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。

一、Sanger双脱氧链终止法原理

通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双　脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。例如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-³²P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3'端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列，见图24-3所示。

图24－3　双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图

二、双脱氧链止终法测定战略

由于DNA一般都由几千个单核苷组成。而目前测定DNA序列的最好方法，一次也只能测约600个核苷酸，因此进行DNA顺序测定前，需要用不同限制酶消化等测DNA，使其降成小片段，分别克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等载体中，分别测定各小片段的顺序，由于不同限制酶产生的片段之间有交错重叠顺序，根据片段间和末端重叠序列，用计算机软件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，进而排出DNA的全序列。

三、双脱氧链终止法测定方法

以M13噬菌体为载体的双氧链终止法的实施步骤为例：

1．M13噬菌体复制型双链DNA（RFDNA）的制备。

为了将待测双链DNA进行克隆，必须制备M13mp18或M13　mp19复制型（闭环双链）DNA，从M9培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌，JM101到50ml2×YT培养基中，37℃振荡过夜。稀释1ml培养物到50ml2×YT培养中，于37℃振摇6h，转移2ml培养物于微量离心管中，12000g，离心5min细菌沉淀保留用于分离复制型RFDNA，上清用于分离噬菌体单链DNA。

细菌沉淀用于分离复制型DNA，可以采用标准的碱解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA试剂盒制备。（方法同分离质粒DNA方法）。

2．重组噬菌体制备

采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNA，并采用相同内切酶切割M13噬菌体RFDNA（采用Biol 101gene clean Ⅱ试剂盒分别纯化内切酶切割后的DNA片段），然后将待测外源DNA片段与M13复制型载体DNA连接过夜，连接反应物转染JM101感受态细菌，将连接物10μl与200μl感受态细菌混匀，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鲜的静止相JM101培养物混匀，然后分别以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培养基上，于37℃培养8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色或称无菌噬斑，即为阳性重组噬菌体。

3．单链噬菌体DNA（模板DNA）的制备

上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNA分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的DNA。为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的OD600=0.1的大肠杆菌JM101培养物中，于37℃振摇5h左右，12000g离心10min，上清转移到另一新微量离心管中用于分离单链DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl 200μl沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去噬菌体蛋白，最后用1/10体积的3m NaAc和乙醇沉淀单链DNA，浓度调至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的Wizard TM M13DNA纯化试剂盒分离纯化M13单链DNA。

4．引物制备

可以购买通用引物或实验室合成15bp～26bp长度的引物，通常以2μg/ml的浓度贮存于-20℃备用。

5．微量滴板

进行大批量的模板测序时，常在密闭的微量离心管中进行与引物的退火反应，然后在微量滴板中进行链延伸-链终止反应。

6．变性聚丙烯酰胺凝胶

测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：①长度通常为40～50cm；②宽度通常为20cm；③厚度通常为0.3～0.4mm；④横截面形状为楔形或锥形，即顶部薄，底部厚，或者是将底部凝胶缓冲液的浓度提高；⑤加样槽；⑥整块凝胶上的温度应均一。

7．电泳后将凝胶干燥，放射自显影。

8．凝胶上读取DNA序列。

此时读取的是目的DNA的互补链3'～5'的序列。