病毒学研究常选用的实验动物有金黄地鼠、小白鼠、豚鼠、家兔、绵羊、禽类、猴等。分离病毒广泛使用的是乳鼠,它对柯萨基病毒、呼吸道肠道病毒和虫媒病毒感染有高度易感性。许多柯萨基病毒A型直到目前仍然不能在1月龄小白鼠以外的任何非人的宿主中培养。因此,目前研究虫媒病毒常选用小白鼠乳鼠及刚断乳的幼鼠,A型柯萨基病毒需用出生一天内的小白鼠培养。用感染乳鼠脑制备补体结合抗原,滴度常较高且非特异性仅应较少。
其他实验动物,如成年小白鼠、兔、豚鼠、雪貂在人类病毒学的发展史上曾起过关键性作用,但目前它们主要用来研究病理机制、制备诊断用品等,并不用于分离病毒。灵长类动物广泛用于致病性研究,特别是可能由“慢病毒”感染引起的一些疾病。
选用作病毒学研究的实验动物,应首先考虑采用该病毒的易感动物。不同病毒的易感动物与接种途径见表10-48。
表10-48 各种病毒常用易感动物与接种途径
病毒 | 实验动物 | 接种途径 | |
单纯疮疹 | 家兔 豚鼠 | 角膜、脑内 肉趾 | |
痘苗、天花 | 家兔 犊牛 恒河猴等 | 角膜、睾丸 皮肤 皮肤、角膜、呼吸道 | |
水痘 | 恒河猴等 家兔 | 脑内、睾丸 睾丸、眼前房 | |
鼠痘 | 小白鼠 豚鼠、地鼠 | 皮肤、皮下、肌肉、腹腔、脑内 皮肤 | |
脊髓灰质炎 | 各种猴 棉鼠 小白鼠 金黄地鼠 | 兰辛株Ⅱ型 | 脑内、鼻内、腹腔 脑内、扁桃腺、腹腔 脑内、脊椎内 脑内 |
柯萨基、甲型 风疹 | 初生小白鼠 乳小白鼠 雪貂 | 脑内、肌肉、腹腔、皮下 皮下、腹腔、鼻腔、静脉 皮下、脑内 | |
口蹄疫 | 幼龄豚鼠 乳小白鼠 | 足趾 脑内 | |
狂犬病 | 家兔 小白鼠、地鼠、大白鼠、犬 猫、鸡、猴 | 脑内、皮下 脑内 | |
水泡性口膜炎 | 豚鼠 小牛 | 足趾 舌粘膜 | |
流感 | 雪貂 小白鼠(传代适用、甲、乙型) 猴 | 鼻内 鼻内 鼻内 | |
猪流感 | 小白鼠 雪貂 | 鼻内 鼻内 | |
腮腺炎 | 恒河猴等 | 脑内、腹腔、静脉、腮腺 | |
麻疹 | 恒河猴(部分可用豚鼠、家兔) | 皮下、肌肉、静脉、脑内、脑腔 | |
新城疫 | 鸽、鸭、鸡、鹅、燕、麻雀 | 脑内、鼻内、神经外 | |
乙型脑炎 | 小白鼠 恒河猴 | 脑内、腹腔、皮下 脑内、鼻内、皮下 | |
春夏型脑炎 | 小白鼠 绵羊 恒河猴 | 脑内、腹腔、静脉、皮下 脑内 脑内 | |
登革热 | 恒河猴等 小白鼠乳幼鼠(传代适应) | 脑内 脑内 | |
马脑脊髓炎(各型) | 小白鼠 豚鼠 家兔 | 脑内 脑内 脑内 | |
羊跳跃病 | 小白鼠 大白鼠 地鼠 | 脑内、腹腔、鼻内 脑内 脑内 | |
在进行肿瘤病毒研究时要注射选择病毒的自然宿主和实验宿主动物。因为病毒与肿瘤关系主要来源于实验动物的研究,实验动物的选择很重要。动物肿瘤病毒因所含核酸不同而分为两类,即RNA肿瘤病毒和DNA肿瘤病毒。RNA肿瘤病毒有三种电镜形态,称为A型、B型和C型。最常见的为C型颗粒。DNA病毒中,有多种能引起动物肿瘤。其大小不一,最大的病毒如痘病毒、疱疹病毒、传染性软疣病毒,最小的病毒如多瘤病毒。动物DNA、RNA肿瘤病毒的自然宿主和实验宿主情况见表10-49和表10-50。
表10-49 动物RNA肿瘤病毒
病毒组 | 肿瘤 | 简称 | 自然 宿主 | 自然肿瘤发生 | 实验宿主 | 病毒形态 | |
机体 | 细胞 | ||||||
鸟病毒组 | 白血病 肉瘤 | ALV RSV | 鸡 鸡 | + + | 鸡、火鸡 鸟、猴、啮 | 鸡 鸡、啮、牛、猴、人 | C C |
小鼠病毒组 | 白血病 肉瘤 乳腺癌 | MULV MSV MTV | 小白鼠 小白鼠 小白鼠 | + - + | 小鼠、大鼠、地鼠 同 - | - 小鼠、大鼠、地鼠 - | C C B |
猫病毒组 | 白血病 肉瘤 | EeSV FeSV | 猫 猫 | + + | 猫 猫、狗、兔、猴 | 猫、狗、猴、人 | C C |
其它 | 蛇 地鼠白血病 大鼠白血病 豚鼠白血病 牛淋巴瘤 猴肉瘤 猴乳腺癌 | - llaLV RaLV - - - - | 蛇 地鼠 大白鼠 豚鼠 牛 猴猿 猴 | + - - - + + | - - - - - 猴 | - - - - - 猴 | C C C C C C B |
表10-50 动物DAN肿瘤病毒
病 毒 组 | 宿主 | 自然肿瘤 | 实验宿主 | 大小(毫微米) | 结构 | 成熟部位 | 瘤细胞中成病毒 |
| |
机体 | 细胞转化 |
| |||||||
乳多空病毒组 | 乳头瘤病毒 多瘤病毒 SV40 | 人、牛兔、狗 牛、鼠 猴 | 有 无 无 | 人、兔、牛、狗 小鼠、地鼠 地鼠 | 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、地鼠、人 | 40-55 40-55 40-55 | 20面体对称 20面体对称 20面体对称 | 核 核 核 | 有 无 无 |
腺病毒组 | 人引型 猴6型 牛 鸟型 | 人 猴 牛 鸡 | 无 无 无 无 | 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠 | 大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人 | 70-80 70-80 70-80 70-80 | 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 | 核 核 核 核 | 无 无 无 |
疱疹病毒组 | HSV2 EBC 猴 鸟 蛙 兔 | 人 人 猴 鸡 蛙 兔 | ? ? 无 有 有 无 | 地鼠 猴 鸡 蛙 兔 | 地鼠、人 人 | 100 100 100 100 100 100 | 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 | 核 核 核 核 核 核 | 无 无 无 无 无 无 |
痘病毒组 | 传染性软疣 YaBa 纤维粘液瘤 | 人 猴 兔鹿松鼠 | 有 有 有 | ||||||
病毒敏感动物的研究,一直是病毒学中的重要内容之一。实验动物在人类病毒学发展史上曾起过重要作用,主要用作分离病毒、研究发病机制、抗病毒药物筛选、疫苗效果及完全性鉴定、制备诊断用品等。
实验动物选择,应注意影响动物实验效果的各种因素。不同种属动物对同一致病因素的易感性不同,对一种动物是病原体,对另一动物可能并不致病。即使是同一种属动物的不同品系,对同一刺激的反应也有很大差异。年龄、体重、性别、生理状态、健康情况,往往导致对同一刺激的不同结果。此外,病毒学研究中,接种途径的改变往往导致不同的感染结果。实验中,应尽量利用经微生物控制的动物和纯种动物。
表10-51 各种病毒在鸡胚内的繁殖与接种途径
病 毒 | 鸡胚 日龄(天) | 接种途径 | 培养 温度(℃) | 培养时间 | 繁 殖 | 收 获 |
流行性感冒 | 9~12 | 尿囊腔、羊膜腔 | 33~35 | 36~48小时 | 血 凝 | 尿囊液、羊水 |
流行性腮腺炎 | 9~12 | ″ ″ | 35 | 5~7天 | 血 凝 | ″ ″ |
新城疫 | 9~12 | 绒毛尿囊膜、羊膜腔 | 32 | 4天 | 死亡血凝 | ″绒毛尿囊膜 |
水 痘 | 10~13 | 绒毛尿囊膜 | 37 | 2~3天 | 痘 疱 | 绒毛尿囊膜 |
痘 苗 | 10~12 | ″ | 37 | 2~3天 | 痘疱死亡 | ″ |
天 花 | 10~12 | ″ | 37 | 3天 | ″ ″ | ″ |
单纯疱疹 | 10~13 | ″ | 37 | 2~6天 | ″ | ″ |
带状疱疹 | 10~13 | ″ | 37 | 2~5天 | ″ ″ | ″ |
乙型脑炎 | 6~8 | 卵黄囊、绒毛尿囊膜 | 37 | 3天 | 死 亡 | 鸡胚、尿囊液、绒毛尿囊膜 |
春夏型脑炎 | 6~8 | ″ ″ | 37 | 3~4天 | ″ | 卵黄囊膜 |
东方马脑炎 | 10~12 | 羊膜腔、尿囊腔 | 37 | 18小时 | 死 亡 | 尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜 |
淋巴球性 脉络丛脑膜炎 | 6~8 | 绒毛尿囊膜 | 37 | 3天 | ″ | 绒毛尿囊膜 |
狂犬病 | 7~9 | ″ 羊膜腔 | 37 | 4~6天 | 血 凝 | ″、羊水 |
劳斯肉瘤 | 9~11 | ″ | 37 | 5~10天 | 痘 疱 | 绒毛尿囊膜 |
鸡传染性支气 | 5~6 | 卵黄囊 | 37 | 3~4天 | 死亡或异常 | 卵黄囊 |
管 炎 | 9~11 | 绒毛尿囊膜 | 37 | 3~7天 | ″ ″ | 尿囊液、绒毛尿囊膜 |
(一)RNA病毒敏感动物
1.披盖病毒科
⑴黄热病毒:黄热病毒是披盖病毒科、黄热病毒属(B组虫媒病毒)的原型。所有灵长类可能都易感,其中非洲种类抵抗力较高,只有隐性感染或很轻的非致死症状,而南美及西印度群岛的猴敏感得多。最为敏感的动物是恒河猴,另外可用中国猴(Macacus Sinicus)及断尾猴(M.Speciosus Thibetanus)。小白鼠对黄热病毒也敏感,令人感兴趣的是:纯血清接种的小白鼠尚能很好存活,而以稀释血清接种的小白鼠却于较短时期内死亡。这一奇特现象的理由,可能是由于病人体内血清抗体早期出现之故。应用纯血清时,这些抗体中和了病毒的作用,而当应用稀释的血清时,抗体浓度不足,但病毒在稀释后仍然具有活力。
⑵登革病毒:登革病毒属披盖病毒科中的黄病毒属,小白鼠往往是经常应用唯一实验动物。有几株病毒已对其适应,特别是对新生小白鼠。1~2日龄乳鼠和仓鼠脑内注射病毒后死亡。病毒对小白鼠的适应过程如下:接种年龄2~3周的小白鼠,最好选用abc种,一部分小白鼠接受未经稀释的血清,另一部分则接受稀释至1:100的血清,观察5~6周,杀死明显有麻痹或脑膜炎征象的小白鼠,以其脑组织制或悬液接种于其人它小白鼠。
猴对登革病毒易感,很多种猕猴,食蟹猴,长尾猿,狒狒都可因蚊虫叮刺或注射病毒而受到感染。基本是无症状的隐性感染,但接种后1~7天内有病毒血症,有人报告有轻度白细胞减少。
小鸡、晰蜴、新生或成年豚鼠、兔、仓鼠或棉鼠实验接种后不发生疾病。
个别报告称脑内或鼻腔内接种可使日本黄鼠死亡,未能被证实。
⑶乙脑病毒:乙脑病毒属于披盖病毒科黄热病毒属的B组虫蝶病毒。
实验室内,乳鼠和成年小鼠鼠脑内接种后发生致死性脑炎,腹腔内接种后乳鼠发生致死性脑炎,只有几种小鼠株的成年小鼠发生致死性脑炎。恒河猴、食蟹猴和成年仓鼠脑内接种后发生致死性脑炎,但周围途径接种时只发生无症状的病毒血症。豚鼠和兔脑内或周围接种,蝙蝠、小鸡、和苍鹭周围接种后都只发生无症状的病毒血症。蝙蝠可保持感染,经过冬眠后重新发生病毒血症。
2.沙粒病毒科
⑴胡宁(Juinin)病毒:胡宁病毒是阿根延出血热致病因子。属子沙料病毒的Tacaribe复合群。
豚鼠实验感染Junin病毒时产生类似人类阿根延出血热的致死性疾病。接种后5~8天,感染的动物开始发热,在11~15天体温过低,休克而死亡。病毒血症以及尿和唾液排出病毒一直到死。尸检时采集的主要器官中都有病毒。
乳鼠实验感染时产生典型的病毒性脑炎,死亡率为95~100%,成年小鼠有抵抗力。
⑵拉沙(Lassa)病毒:拉沙病毒属于沙粒病毒科。新生小白鼠脑内接种此病毒引起不显性持续感染。成年小鼠脑内接种后5-7天出现致死性疾病,有痉挛发作,最后后腿强直、呼吸停止。成年多乳鼠实验感染为隐性感染。松鼠猴肌肉接种后,经10-14天潜伏期,动物发生多变的致死性疾病。豚鼠腹腔内接种后,发生呼吸功能不全,约67%的动物死亡。
⑶淋巴细胞脉络丛脑膜炎(LCM)病毒:本病毒与拉沙病毒,马秋堡(Machupo)病毒同属沙粒病毒属,对小白鼠脑内接种尤为敏感,可供分离病毒用,对猴及豚鼠有致病力。
应使用4周龄的小鼠及乳鼠、未断乳豚鼠200-400g重的豚鼠。可能时,采用“瑞士”Albinos种小鼠。饲养中,应确保无LCM病毒感染。为取得最好效果,一方面接种幼年动物,另一方面用年龄较长的。接种量如下:
6-8天龄乳鼠:脑内接种0.03ml,腹腔接种0.2ml。
4周龄小鼠:脑内接种0.03ml,腹腔接种0.25ml。
未断乳的小鼠:脑内接种0.05ml,腹腔接种1ml。
已断乳的200-400g豚鼠,脑内接种0.15ml,腹腔接种5ml。
不同接种途径的感受性亦是不同的。脑内接种感染而发病的鼠数(4周龄以上的)远比经腹腔内接种者为多。经腹腔接种者可不显任何症状。豚鼠(250g以上)二种接种途径的发病数大致相等(有进脑内接种稍高些),但这些资料并不对所有毒株适用。
小白鼠感染后表现多变,可能有三种过程:⑴急性疾病并死亡;⑵急性急病,恢复并产生抗体;⑶形成持久的耐受性感染,携带病毒,不产生抗体。决定因素有:⑴感染的病毒株;⑵接种途径(最为重要);⑶动物感染时的年龄。
产生急性疾病的动物一般在感染后4-7天出现体征。表现为:弓背、竖毛、嗜睡、眼睑炎、头部水肿等。
3.小RNA病毒科
⑴脊髓灰质炎病毒:脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸(RNA)病毒科、肠道病毒属的一种。1908年Landsteiner和Popper成功的把此病毒传播于猴。在后来的40年里证明了亚人类灵长类能经消化道感染,有些株能适应于实验室的啮齿类。
猴子:在此属内,猩猩能感染和人类完全相似的疾病。但此类动物不易常备。实际工作中,各种不同的猕猴对本病来说是猿类中最为优良的品种,特别是Macacus Rhesus。长尾猴类以及狒狒类对脊髓灰质病毒亦有感受性,唯敏感性远较猕猴为差。接种方法很多,脑内注射未必是最佳的,可用:腹腔注射、坐骨神经附近的深部肌肉注射、鼻腔滴注。实验操作中最好以不同方法混合接种。
啮齿动物:病毒在应用啮齿动物前,常需经猿子适用1-2代。啮齿动物(棉鼠、小白鼠、田鼠、鼷鼠)可经脑内接种,最好选用年幼动物、2-3周龄的小白鼠或15天龄的棉鼠。动物常于12-25天出现麻痹。
⑵柯萨基(Coxsackie)病毒:柯萨基病毒属小RNA病毒科肠道病毒属。根据本病毒对乳鼠的致病情况将其分为两组:A组:产生弥漫性肌炎伴有随意肌纤维的急性炎症及坏死。B组:主要引起大脑局部退行性变等。
柯萨基病毒常用的传代和分离方法,是乳鼠脑内、腹腔内或皮下接种。4-5日龄的小鼠对A组病毒的感染仍然敏感。但B组病毒在1日龄或更小的小鼠繁殖最好。即使是成鼠,给予注射可的松、X线照射或感染期间持续暴露于寒冷(4℃,B组病毒)或严重营养不良都可使其对柯萨基病毒易感。通常乳鼠在症状出现后24小时内死亡。除乳鼠外亦可用3周龄以内的鼷鼠(Merion),它有固定的感受性,可用以分离及传代。恒河猴脑内接种A7和A14病毒引起中枢神经系的神经节细胞广泛变性,进而导致松弛性麻痹。
4.布尼雅病毒科
肾综合症出血热病毒(HFRSV)属于布尼雅病毒科、布尼雅病毒属,其敏感动物详述于后。
5.正粘病毒科
流感病毒:属于正粘液病毒属。动物模型最好用雪貂,也可用小白鼠、金黄地鼠、豚鼠、猴及猪。
雪貂:是较为理想的交流感动物模型。白色皮毛的雪貂似较杂色雪貂为敏感。病理材料经鼻腔内接种。雪貂对甲、乙型流感均易感,病毒不经适应即能对雪貂致病,并易传播给其它雪貂和人。其临床表现与人相似,发热,并伴上呼吸道感染。愈后血清中产生高滴度抗体。
小白鼠:对流感病毒敏感。但其症状与人不同,主要表现为下呼吸道感染,并死于肺炎。直接取自患者的材料不宜于小白鼠分离病毒。适用的方法是:有毒材料应①在乙醚麻醉下通过鼻腔接种,②先在雪貂身上适应。
金黄地鼠:地鼠对研究流感温度敏感变异株很有用处。地鼠为隐性感染,但可在鼻、肺部测出病毒繁殖量。有利之处是:其体温和鼻部温度与人的相似。对人毒不同的流感病毒温度变异株,在地鼠机体也表现出相似的差异。
6.副粘病毒科
⑴麻疹病毒:除灵长类外,一般动物均不易感。1911年首次成功地传给猕猴。以后证明,除了接触和吸入外,其它种类的猴,如:猿类、恒河猴、崇猴、爪哇猴、倭猴等,对各种不同接种途径也易感。其症状类似人类麻疹。潜伏期为3-22天,病毒血症期为4-15天,约一半动物有皮疹、结膜炎、卡它和发热。
适应在组织培养上的病毒可在乳腺或乳地鼠体内繁殖,脑内接种可引起脑膜炎症。
⑵呼吸道合胞病毒:猩猩感染后可产生与人一样的上呼吸道临床症状。
猴,Cebus猴感染本病毒后,可引起肺炎。在肺和支气管都可以找到呼吸道合胞病毒抗原。Cebus猴感染后4-6天,病毒繁殖方可达高峰,并出现临床症状。
雪貂年龄愈小,病毒繁殖量愈大。3日龄雪貂,鼻内感染时其肺部病毒量可达105PFV/g肺组织,7-14龄雪貂,肺病毒量仅103-104PFV/g肺组织;28日龄的雪貂,其肺内测不出病毒繁殖量。
此外,地鼠和棉鼠对呼吸道合胞病毒较敏感,感染后,在其细支气管及肺可以找到呼吸道合胞病毒。
7.弹状病毒科
狂犬病毒(Rabies Virus):1987年Galfiev 首先用家兔作为实验动物,进行了传统的实验,在该实验中,巴斯德培育了对犬致病力减弱而对家兔具有固定潜伏期的病毒。
为了建立实验室感染,常选用:中国地鼠、小白鼠、豚鼠和兔(按敏感性程度排列)。颅内接种比皮下或肌肉注射更可靠。
小白鼠的狂犬病毒伏期一般为8-14天,很少超过20天。表现为竖毛、弓背、活跃兴奋或淡漠无力,进而战栗,后肢瘫痪,死亡。
家兔:初始症状为瞳孔扩张,数小时后呼吸困难、瘫痪,潜伏期一般为12-25天。
豚鼠:潜伏期比家兔短,当发生症状后,常有兴奋期,此时,动物变得凶暴,最后瘫痪。
(二)常见DNA病毒的敏感动物
1.痘病毒科
天花病毒:猴及家兔均敏感。应选用雄兔作皮肤划痕接种、角膜划痕接种、睾丸内接种。猴子则在胁腹部皮肤上作划痕接种,如系雄猴则同时作睾丸内接种。感染后兔皮肤上出现明显的皮疹,局限于皮肤划痕处;角膜炎性轻微或缺如,无睾丸炎。猴沿皮肤划痕出现典型皮疹,如做睾丸内接种,则有睾丸炎发生。
2.疹病毒科
⑴单纯疱疹病毒(HSV):家兔为最适宜的动物,豚鼠、小白鼠、地鼠亦可用。用家兔及豚鼠的原因之一,是因为可以用有菌材料做角膜接种而可不加抗菌素或过滤,不妨碍病毒生长。
家兔角膜途径接种:导致角膜结合膜炎。脑内途径接种:出现脑炎症状,最后死亡。
豚鼠角膜接种:病损如家兔。脑内接种:有发热,偶而有脑炎症状。
皮肤接种:最好在足蹠皮内作划痕,皮肤可出现皮疹,最后可能死亡。
小白鼠:最好用新生小鼠。经脑内或腹腔接种。动物呈脑炎症状,最后死亡。亦可同时接种一批“病毒-抗疱疹标准血清”混合液,以观察第一批动物死亡及第二批动物存活情况,以签定病毒。
⑵水痘一带状痘疹病毒(VZV)、巨细胞病毒:还未发现有实验动物对这两种病毒敏感。
(三)未分类病毒的敏感动物
1.甲型肝为病毒(HAV)
1967年Deinhardt等首次证明HAV可在狨猴体内增殖,此后Mascoli等从狨猴体内发现人类HAVCR326株。
狨猴、黑猩猩、红面猴对HAV均易感,经口或静脉注射接种病毒后,可产生肝炎。
肝组织呈现肝炎的病理改变。细胞浆内查到HAV抗原,恢复期血清中检测出相应抗体,粪便中可排出HAV颗粒。
2.乙型肝炎病毒(HBV)
黑猩猩是HBV的易感动物。狨猴虽可感染但不如前者敏感。因此用黑猩猩研究HBV的发病机理、检测自动免疫、被动免疫的效果以及HBV疫苗的安全性。
目前为止,各种病毒敏感动物的研究。仍然是病毒学中引人瞩目的的领域,因为在不同病毒疾病发病机制的研究、抗病毒药物筛选、疫苗效果及安全性鉴定等方面,动物模型都有其独特的优越性。但就病毒分离而方,使用组织培养的方法,对于某些病毒更为方便。不同实验室可根据其实验目的、动物来源情况等,选择不同的敏感动物。
肾综合征出血热病毒(HFRSV),属布尼亚病毒科(Bungavividae)中的一个新属,称为汉坦病毒属。自1978年南朝鲜李镐汪首次以疫区黑线姬鼠肺分离到HFRSV(亦称汉坦病毒Hantaan Virus,HTNV)后,对其动物模型进行了众多的研究。
(一)HFRS感染动物模型
感染动物模型的亚临床感染,亦无明显病理变化,主要用于病毒分离和传代。目前有:非疫区黑线姬鼠、大白鼠、长爪沙鼠、家兔等。
1.黑线姬鼠
非疫区黑线姬鼠是最早用于病毒分离和实验研究的动物。据报道用各种途径(肌肉、皮下、肺内、鼻内、或经口)接种均可使黑线姬鼠感染。皮下和肺内接种0.1ml汉坦病毒或待检其其它材料后,10天左右肺部出现病毒,以后在肾、肝、颌下腺中可检出病毒。约接种后20天,肺中病毒滴度最高,以后逐渐下降,但150天后仍可检出。
黑线姬鼠为野生鼠类,常有野生啮齿类病毒的污染,加之来源、人工饲养、繁殖等问题较难解决,因而使用受到一定限制。
2.大鼠成鼠
1981年Leepw等将朝鲜出血热病毒接种到雌性、1月龄Wistar和Fisher大鼠。这是首次将该病毒接种于实验大鼠,肌肉接种0.5ml汉坦病毒后14-65天,肺内可发现其特异性抗原;接种后三周,血清中可检出特异性抗体,除脾脏亦可查到特异抗原外,与黑线姬鼠脏器的抗原分布相同。
朝鲜出血热病毒对实验室大鼠的适应,提供了无野生啮齿类病毒污染的实验模型。现已应用于特异性药物治疗研究。
3.长爪沙鼠成鼠
1983年朱智勇等发现长爪沙鼠对HFRSV敏感。六种途径(肺内、皮下、腹腔、口腔、肌肉)接种,第1代即可感染,无需传代适应;脏器内检出特异性荧光部位与黑线姬鼠相同。接种病毒后4天,肺组织中查见病毒抗原,5-7天过高峰,通常于10-14天消失。接种后8天,查到抗体,14天达高峰。长爪沙鼠可用多种宿主动物体内HFRSV的分离,且在较短时间内即可获得毒株。而且,这些毒株可用于疫苗的研制。
4.家兔
HFRSV感染的家兔,与长爪沙鼠成鼠一样,亦为无症状短期自限性隐性感染。不同来源的HFRSV,除口饲外,肌肉、腹腔、肺内、皮下接种均可使家兔感染,并能在体内连续稳定地传代,但不表现任何症状。接种后4天,有持续数天的病毒血症,7-14天可在多种器官内找到病毒抗原,以脾、小肠、胰腺中为明显,肺、肝、肾等组织内偶尔可见,8-9天抗原量最多,同时在血液中开始查到相应抗体,随抗体效价增长体内病毒抗原很快减弱,至第15天完全消失。
初步实验表明,R3和76/118株都能使乳兔感染,其表现与成兔相似,全身多种脏器组织内可检出病毒抗原,但其荧光亮度更强,提示乳兔对HFRSV更敏感。
(二)HFRS致病动物模型
致病动物模型为显性感性甚至死亡,并伴有明显病理改变。主要用于发病机理研究、药物筛选等。目前有小白鼠乳鼠、大鼠乳鼠、裸鼠及环磷酰胺处理的金黄地鼠。
1.小鼠乳鼠
Tasi等报道了第一个致病动物模型,即新生小白鼠(2-4龄)。相继发现CD-1、ICR、Balb/等品系乳鼠均对HFRSV敏感。颅内、腹腔、肌肉、皮下接种均可使其感染。我们的研究发现:颅内、腹腔联合接种与单纯颅内接种,在发病时间、抗原分布上无明显差别。但腹腔接种乳鼠发病时间要比脑腹联合接种及单纯脑内接种平均迟4-5天。病毒抗原广泛分布各脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺),脑内接种0.02ml经乳鼠传代适应的汉坦病毒76/118株(LD50、10-6·5/0.02ml),乳鼠第7天开始发病,表现为蜷缩、活动减少、耸毛、弓背、尾强直、后肢麻痹,直致死亡,发病规律。
乳鼠现已成功地用于病毒分离、繁殖高滴度HFRSV,并被用于研究不同来源毒株的毒力及测定疫苗效力和安全性、筛选抗病毒药物及研究发病原理。
2.大鼠乳鼠
Fishet大鼠(E344/N)出生后24小时内,分别颅内接种HFRSV76/118株和B-1株(分离自实验室大鼠),死亡率分别为18.8%、42.9%。腹腔分别接种上述两种毒株,观察至第50天,仍未见死亡。
3.金黄地鼠
每只地鼠腹腔一次注射200mg/kg环磷酰胺,48小时后,腹腔或皮下注射病毒悬液1ml,或脑内接种0.05ml。绝大多数动物在感染后7-9天病死。在病死地鼠的各器官均发现有HFRS病毒抗原,并分离到病毒。各器官的病理变化酷似人体出血热病变。
4.裸鼠
14-42天龄的CK-1无胸腺裸鼠,脑内接种104·4PFU(0.02ml)汉坦病毒76/118株后40天,表现有体重减轻、活动减少、站立不稳、嗜睡等,最后全部死亡。而其同龄同窝兔功能正常鼠不发病。
我们用乳鼠适应的汉坦病毒76/118株感染了21日龄NIH品系的无胸腺裸鼠,感染剂量2.5×105LD50,(脑腹联合接种,0.02ml/脑,0.05ml/腹)。最早于第8天开始发病,表现为活动减少、互相抱团、食欲减退、体重减少、弓背、后肢麻痹,于20天内全部死亡。而接种相同量病毒的同窝免疫功能正常鼠则不发病。脑、心、肝、脾、肺、肾均有特异抗原,脑内抗原荧光最亮。初步观察了人白细胞干扰素对裸鼠感染的保护作用,剂量为:20×106μ/kg,腹腔内给药,自病毒感染当天开始,连续用药6天,发现治疗组比对照组存活时间延长1.5-3天,进一步的研究正在进行中。
(三)灵长类和树鼩
灵长类的研究尚无肯定的结果。
非洲绿猴、脑内接种HFRSV后,观察7周,未见临床症状及病理变化。Amyx等发现猕猴和黑猩猩接种后,可有规律地出现短暂蛋白尿、病毒血症,偶见痰质血症。在日本,用HFRS病毒接种幼龄猕猴(Cynomolgus)后7周,可见有与HFRS病人相似的病理变化:肾、肺、脾、心脏和肝可见毛细血管扩张、部分脏器可见弥漫性血管内凝血(DIC)、肾髓质集合管退行性变、感染3-4周有蛋白尿,并在组织中检出抗原,但未观察到临床症状。看来猕猴可能有希望做为较好的致病研究模型。
国内未志勇等将R3株病毒接种三只恒河猴(3~4岁),研究HFRS病毒在猴体内的分布、增殖和排出,研究结果表明,接种病毒后3~5天即出现病毒血症,直至血液中检出抗体前2天止,持续8天之久;猴产生抗HFRS抗体时间在接种后第14天,且IgG和IgM抗体同时出现;病毒血症期直至产生抗体上,猴体内各器官组织未发现病毒增殖。此时粪便和尿都未分离出HFRS病毒。从而可推测HFRS病毒在猴体内增殖的部位可能是循环血细胞内,这与近年来证明该病毒在病人血细胞内增殖相符。
最近严玉辰等将A16株病毒接种于六只树鼩,每只由皮下和脑内混合接种10-1病毒悬液1ml。结果:1~2号树鼩于接种后7天死亡,经检测脏器抗原皆阴性,死后查血清抗体阳性。3~6号树鼩接种病毒后,经2~4次尿抗体检查均阴性,血清抗体皆阳性。接种病毒7天后,均有不同程度的体温增高现象。其中5号树鼩于接种病毒在9天死亡。抗原在树鼩脏器组织中的分布颇为广泛,但1~2号小兽血中有抗体,脏器内未检出抗原,何种原因尚待研究。初步看来此种小兽对HFRS病毒较敏感,但非理想的敏感动物。其不同年龄、不同毒株、不同剂量的实验,有待进一步深入研究。(本节常见病毒敏感动物的选择资料由王晶翼同志提供)。