1 试剂
1.1 2mol /L 盐酸羟胺，冷处保存。
1.23.5mol /L 氢氧化钠。
1.3 4mol /L 盐酸
浓盐酸（比重1.18）1份，加2份蒸馏水稀释。
1.40.37mol /L 三氯化铁（FeCl3·6H2O），溶解于0.1mol /L 盐酸内。
1.50.001mol /L 醋酸钠（pH4.5）。
1.62.5mmol /L 的氯化乙酰胆碱液
精确称取已干燥至恒重的氯化乙酰胆碱22.7mg，用0.001mol /L 醋酸钠液（pH4.5）溶解，移入50ml容量瓶中，用0.001mol /L 醋酸钠液稀释至刻度。
2 操作
2.1 样品
精确量取样品1ml（含O-乙酰基0.5～2.5μmol）置于试管中，加2ml新鲜配制的碱性羟胺液（等体积的2mol /L 盐酸羟胺与3.5mol /L 氢氢化钠混合，3小时内可用），摇匀，于室温放置4分钟，加1ml 4mol /L 盐酸，使pH为1.2±0.2，摇匀，加1ml 0.37mol /L 三氯化铁，摇匀，于540nm比色，同时作一样品空白，取样品1ml于试管中，先加1ml 4mol /L 盐酸，后加2ml碱性羟胺（即加酸与加碱性羟胺的次序颠倒），加三氯化铁等操作同上。
2.2 标准曲线
精确量取氯化乙酰胆碱（或溴化乙酰胆碱）标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，其余操作同样品，同时作标准空白，即作与上相同的系列标准管，只是加酸与加碱性羟胺的次序颠倒，其他操作均同。
3 计算
标准管比色读数分别减去各自空白比色读数，然后画出标准曲线。样品比色读数减去其空白读数，再从标准曲线查出品相当标准液之ml数A。
样品O-乙酰基含量（mmol /L）=A×2.5
附注
也可采用WHO规程法，但应相应提高样品用量。