用PCR-SSCP 区分不同来源的幽门螺杆菌

幽门螺杆菌（Hp）感染在人群中广泛存在，Hp的分型鉴定对其感染的临床及流行病学研究具有重要意义。国外文献报道的几种基因型技术使Hp的分型鉴定成为可能，而PCR及单链构象多态性（Signle-strand conformationpolymorphisms,SSCP）分析在菌株分型鉴定中的应用则尚未见报道。作者采用PCR-SSCP分析区分不同来源的Hp，并探讨其应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848来自英国伦敦国家标准培养物收藏中心，由本院传染科保存并提供；112株临床分离鉴定的Hp来自97名因上胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，经内镜及病理诊断证实十二指肠溃疡49例，胃溃疡5例，慢性胃炎43例。所有病人在内镜直视下于胃窦取粘膜活组织一块做细菌培养，其中包括1例未经治疗相融8个月复查胃镜者，4名病人还另于胃底或十二指肠球部取粘膜活组织一块做细菌培养，10例十二指肠溃疡伴Hp感染者于抗生素治疗停药4周复查胃镜，取胃窦粘膜活组织两块分别做细菌培养及PCR方法直接检测Hp。

1.2 模板DNA的准备培养细菌或研碎的活检胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k，55°C消化1h，以等体积苯本分氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提，12000rpm离心10，吸取上层水相，加2.5倍体积冷无水乙醇12，000rpm离心10min沉淀DNA，以100μl无离子溶解DNA，1μl用于PCR扩增。

1.3 PCR扩增Hp基因组 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已证实对HpDNA特异，扩增片段长度为203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mMMgcl2,0.01%明胶，各200μdNTP，各0.5μMCAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA聚合酶（中科院遗传所产品）。反应条件：94°C5min,1个循环；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35个循环；72°C10min，1个循环。以HpNCTC11637DNA为阳性对照，去离子水做阴性对照。

1.4 PCR产物的SSCP分析 PCR产物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C变性10min,加3μl电泳加样缓冲液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈蓝）混匀，于7.5%聚丙烯酰胺胶室温电泳300V，3.5min，以0.19%硝酸银染色30min，经显色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化钠）显色后观察结果，比较不同Hp菌株两条单链DNA片段的迁移情况。

2 结果

2.1 PCR-SSCP方法的重复性 相隔半年转种得到5对Hp菌株，每对菌株203bpPCR产物的SSCP分析均显示完全相同的单链构象；同一菌株203bp PCR产物在不同聚丙烯酰胺胶上都呈现相同的单链构象，使不同凝胶上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。

2.2 Hp基因组DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段变性后的两条单链，在中性聚丙烯酰胺胶中电泳的迁移率不同，从而形成不同的单链构象。来自97名病人的分离菌株及2株标准菌株产生7种不同的单链构象。通过比较不同的单链构象。通过比较不同Hp菌株的单链构象，将这97名病人的菌株分成6组（见表1）。同一病人相隔8个月分离培养的菌株，其203bpPCR产物的单链构象稳定不变；4个病人不同培养部位的4对Hp菌株分别具有相同的单链构象。

表1 Hp标准菌株来自97名病人的临床分离菌株的分组情况

2.3 治疗前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治疗后停药1月或1月以上复查，发现6例细菌培养仍为阳性，4例细菌培养阴性而PCR检测仍为阳性。对这10例病人治疗前后菌株的PCR-SSCP分析，发现9例病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，1例病人治疗前后的单链构象不同。对其中2例治疗后仅PCR为阳性的患者，于停药5个月～6个月复查时发现细菌培养转为阳性，并与治疗前菌株具有相同的单链构象（表2）

表2 10例Hp感染者治疗前后菌株的PCR-SSCP分析

**B-治疗前菌株；A-治疗后菌株；a-治疗后仅PCR阳性

表2中同时列出不同组别菌株的疾病来源，未发现不同组别的菌株与某一疾病有确定的关系，未发现与十二指肠溃疡或胃溃疡密切相关的Hp菌株。

3 讨论

不同Hp菌株DNA分子具有多态性，PCR-SSCP分析作为检测DNA多态及基因突变的方法，有可能检出这一多态性，从而区分不同来源的Hp菌株。本研究用PCR-SSCP分析鉴别不同Hp菌株方法简单、可靠、重复性好，通过比较97名病人的临床分离菌株及2株标准菌株基因组DNA203bp片段的两条单链DNA，在聚丙烯酰胺胶中的电泳迁移率，将这些被检菌株分成7组，表现出中等度的分辨力。它虽然不能将所有不同病人来源的菌株逐一区分，但可对流行病学上某特定人群的菌株分组从而可以比较不同人群中感染的Hp有无差异。

本研究中显示74%的菌株具有相同的单链构象，推测可能是北京市区人群Hp感染的主要菌型。本结果还证实同一病人相隔8个月分离的菌株，其203bp片段的单链构象稳定不变，这与文献中报道的同一病人2年内连续分离的多株Hp，其染色体DNA酶切图型保持不变的结果相似。对来自4名病人不同部位的4对Hp菌株的PCR-SSCP分析，未发现同一病人有不同类型Hp菌株的混合感染。Petwett等用Southern印迹法对来自15个病人的胃窦、胃体及十二指肠球部的64株Hp核糖型分析，发现2个病人分别感染了两株不同的Hp。本文观察的病人数不多，尚难做结论。

对10名病人治疗前后菌株的PCR-SSCP分析，发现9名病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，认为是治疗后同一菌株的复发。1名病人治疗前后的菌株单链构象不同，可能是治疗后获得了新菌株的再感染，或药物治疗导致原来感染的菌株变异但也不排除两株不同类型Hp菌株混合感染的可能。PCR-SSCP分析用于治疗后Hp复发和再感染的鉴别与文献报道相类似，但由于不同Hp菌株也可有相同的SSCP图型，使该方法对治疗前后菌株的鉴定不够精确，进一步研究可通过选择扩增DNA多态性更为显著的片段，或许可以对治疗前后菌株复发及再感染做出更精确的判断。PCR-SSCP方法用于治疗前后菌株的鉴定，可以从活检胃粘膜中直接增出DNA片段用于SSCP分析，省却了细菌培养的繁琐耗时的过程，特别适用于那些治疗后细菌培养无法检出，而实际上仍然少量存在的Hp菌株的鉴定，这是其它菌相提并论鉴定方法难以达到的。研究表明，Hp存在着致病力不同的两组菌株，它们致病力的不同表现在与不同的病症的关系上。Tee等用Southern印迹法对Hp核糖带型的研究，未发现Hp的核糖型或核糖型的某条带与临床疾病有对应关系、Yoshimara等用DNA-DNA杂交技术证实，十二指肠溃疡和无症状胃炎病人感染的Hp有明显的遗传学差别。本研究对不同Hp菌株基因组DNA203bp片段的SSCP分析，未发现与临床某一疾病相关的细菌DNA单链构象，可能由于该片段编码的信息与Hp的致病力无关，对Hp毒素相关基因的分析或许可以发现与不同疾病表现相关的菌株，有待今后进一步研究。