幽门螺杆菌全菌抗原与尿素酶抗原ELISA血清学检测的应用

大量研究资料证明，幽门螺杆菌（H.pylori，Hp）是人类慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌且与胃癌的发生密切相关。它可通过胃粘膜活检组织尿素酶试验和Hp培养来诊断其感染，但病人必须接受胃镜检查，由于检查时痛苦较大，更不易被复查和随访患者接受。Hp的尿素酶抗原可刺激机产生高滴度的循环抗体，其中IgG抗体滴度在未经系统抗Hp治疗的人群中，能确切地反映人体内目前有无Hp感染，在感染病人经抗Hp治疗杀灭了体内Hp3～6个月后，IgG抗体滴度能下降25％～50％，因此可客观地反映治疗效果。

1　材料和方法

1.1　血液标本

血液标本676例患者，平均年龄43.5岁（18岁～87岁），主要症状为上腹痛及（或）食后上腹胀、恶心或呕吐、烧灼感染、反酸、嗳气、食欲不振。少数病例经胃镜检查，结果正常胃炎等器质性病变。采取肘静脉血2ml进行检测。

1.2　Hp尿素酶纯化抗原的制备

①菌株选择及细菌培养：实验选择尿素酶活性高的Hp菌，接种含6％脱纤维羊血的布氏平皿中，置混合气体（5％O₂、10％CO₂和85％N₂）环境中，37℃培养3d后收菌。②细菌破碎及预处理：将收集之Hp菌用生理盐水洗2遍后，用凝胶过滤洗脱液将菌稀释至15亿菌/ml，用超声波在冰浴中进行破碎后，经高速离心12000r/min，30min后取上清备用。③凝胶过滤用SephadesG200柱进行，洗脱液测定尿素酶活性并将其活性峰与相应菌全菌蛋白，上柱液及离心沉渣进行SDS－PAGE分析，观察尿素酶提纯效果，Western blot分析是将尿素酶活性峰，经SDS－PAGE将各蛋白分离后，经电泳将蛋白转移到硝酸纤维膜上，处理、染色照相，并记录结果。

1.3　血清抗Hp尿素酶抗体的检测

血清抗Hp尿素酶抗体的检测：采用ELISA（按照Kesumen法改良），检测对象为门诊受诊的各类胃病患者共676例，经纯化尿素酶抗原包被的40孔（或96孔）酶标板，用0.5％明胶0.1ml37℃作30min封闭，用洗涤液洗板三次，加入待检血清并以特异性抗HpU抗体的含量为66μg/ml标准阳性血清作为判断村准。加二抗HRP　SPA，用PBST20稀释后，每孔加入0.1ml，37℃孵育30min，洗板3次后，在避光条件下与底物液中加入适量30％过氧化氢及邻苯二胺，溶解后，每孔加入0.1ml，37℃孵育，显色5min～10min，加2mol/LH₂SO₄终止液每孔0.1ml，用49nm波长测吸光度（A）[旧称光密度（OD），下同]（或目测）。目测观察：颜色浅于或等于标准阳性对照者为阳性，颜色深于标准阳性对照者为阴性。仪器测定：以酶标仪测定各孔吸光度（A）大于或等于标准阳性对照者为阳性，吸光度（A）小于标准阳性对照者为阴性。当标准性对照吸光度（A）大于或等于0.2时，若阴性对照吸光度（A）小于0.1则试剂盒有效。ELISA特异性经吸收试验鉴定，确定与空肠变曲菌（C.jejuni）、结肠变曲菌（C.coli）及海鸥变曲菌（C.laris）无交叉反应。

2　结果

2.1　HpU抗原纯化

应用SephadesG200柱，从Hp超声破碎物离心上清液中，一次性提纯了Hp尿素酶抗原。SDS—PAGE分析结果表明，所提取的Hp尿素酶抗原中仅含有66KD及30KD两种蛋白成分，与Hp尿素酶蛋白两种亚基的大小完全相同，提取物中几乎不含有其他杂蛋白成分，经Western blot分析，证明所提纯的Hp尿素酶抗原仍具有良好的抗原性。

为了检测HpU纯化抗原的敏感性与特异性，实验选择经Hp全菌蛋白抗原对人血清特异性抗Hp－IgG抗体检测的阳性及阴性各类胃病（慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎等）患者血清各50份进行对比研究，结果用混合多型HpU纯化抗原比全菌蛋白抗原为敏感，且特异性高（表1）。

表1　Hp全菌抗原与尿素酶纯化抗原ELISA法检测比较

X²＝6.38，P＞0.025

2.2　人血清特异性抗HpUIgG抗体的测定：用目测和酶标仪测定胃病患者人群中血清抗HpUIgG抗体。按表2分析，以特异抗HpU抗体的含量为66μm/ml标准阳性血清作为判断标准，ELISA法与免疫印迹分析对照，敏感性为98％，特异性为96％。

表2　676份病人血清抗幽门螺杆菌尿素酶抗体ELISA检测结果

3　讨论

Hp是人胃内唯一产生高活性尿素酶的细菌，可通过检测胃内尿素酶的活性来诊断Hp感染，现已发展了多种检测方法，如14N尿素酶排泄试验。¹³C或¹⁴C_—呼吸试验，均有较高的敏感性和特异性，但是以上几种方法均需要特殊的检验设备和技术，不易在基层推广和应用，因此血清中Hp特异性抗体的检测，在检出与Hp相关性胃炎的诊断中尤为重要，与侵入性诊断方法或呼吸试验相比，血清学诊断易为患者接受，而ELISA法则更为常用，若用患者自身菌株作抗原较用标准菌株作抗原在ELISA试验中更能观察到明显的IgG滴度。

目前应用于ILISA抗原有三类：①全细胞抗原和超声粉碎物抗原；②部分纯化抗原；③高度纯化抗原。Hp全菌细胞和未纯化的细胞超声波粉碎物抗原，用于Hp感染的血清学诊断一般特异性不高。用Hp多种抗原制品的混合物纯化的纯化尿素酶组分抗原，则可获较高的特异性与敏感性。

实验采用ELISA法对676份人血清进行了抗HpU抗体的检测，以特异性抗HpU抗体的含量为66μg/ml标准阳性血作为判断标准，其敏感性及特异性各为98％及96％。

对于Hp阳性的慢性胃炎，抗菌治疗是一种新的治疗方法，我们已往研究表明慢性胃炎，尤其是活动性胃炎与Hp感染更是密切相关，在抗菌治疗前后用ELISA法检测血清Hp抗体，抗菌治疗后抗体滴度明显下降，与Hp清除有关，炎症程度减轻（活动性胃炎症消失）具有相关性。非溃疡性消化不良（NUD）是常见的临床症候群，目前对其病因认识尚不清楚，一般认为是多样性（heterogeneous），其中慢性胃炎占很大比例，而与Hp感染密切相关，经胃镜胃粘膜活检有半数以上有Hp存在，故认为Hp在NUD病人中有一定致病作用。人群血清抗HpU抗体ILISA法检查，属于创伤检测，可用作初筛检查，以后随访，可免去病人多次胃镜检查之苦，节省不必要的检查费用，减少交叉感染机会，有较好的依从性（compliance）和可靠性。总之，用血清抗HpU抗体ELISA法检测，对于慢性胃炎及非溃疡性消化不良中Hp抗体的检出，抗菌治疗方案的确定，抗菌治疗方案的随访与评价及流行病学调查研究，是一项简便、可靠、实用的方法。