人膀胱癌细胞耐药株多基因蛋白表达的意义

中华泌尿外科杂志 1998年第12期第19卷 论　著

作者：陈忠　章咏裳　李家贵　张永幸

单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院泌尿外科(陈忠、章咏裳、李家贵)，同济医科大学公共卫生学院(张永幸)

　　关键词： 膀胱肿瘤；细胞株；凋亡；耐药性

　　摘要　为研究膀胱肿瘤细胞耐药机制，使用药物浓度递增的方法，分别采用阿霉素(ADM)或足叶乙甙(VP-16)建立了人膀胱癌耐药细胞株BIU-87/A和BIU-87/V，并进行了耐药倍数分析。BIU-87/A对ADM、VP-16的耐药倍数分别为57.4、59.4；BIU-87/V对ADM、VP-16的耐药倍数分别为6.5、5.4。采用免疫组化的方法分析P53、bcl-2蛋白和P-糖蛋白(P-gp)在细胞中的表达，结果显示BIU-87三种蛋白均阴性，而BIU-87/A、BIU-87/V的三种蛋白均阳性，且BIU-87/A的表达量均多于BIU-87/V。结果说明突变型P53蛋白、bcl-2蛋白和P-gp表达在细胞耐药机制中可能起重要作用。

　　Induction of drug-resistance and P53,bcl-2 and P-glycoprotein proteins expression by adriamycin or etoposide in human bladder cell lines.　Chen Zhong^*,Zhang Yongshang,Li Jiagui,et al.Department of Urology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030

　　Abstract　To study drug-resistance mechanism of bladder tumor,drug-resistant cell lines BIU-87/A or BIU-87/V were established by continuous selection from human bladder cancer cell line BIU-87 cultured in medium by increasing dose of adriamycin (ADM) or etoposide (VP-16).The BIU-87/A cell was 57.4,59.4 times more resistant to ADM and VP-16 than the BIU-87 parent cells.The BIU-87/V cell was 6.5,5.4 times more resistant to ADM and VP-16.Protein products of P53 and bcl-2,P-gp were detected by immunohistochemical method in cell lines.All were negative in BIU-87 cell,but all were positive in BIU-87/A and BIU-87/V cells.The three protein levels were significantly higher in BIU-87/A than in BIU-87/V.The data demonstrated that expressing of mutate P53 and bcl-2,P-gp may be an important determinant of tumor response therapy.

　　Key word　Bladder neoplasms　　Cell line　　Apoptosis　　Drug tolerance

　　本研究采用免疫组化方法观测P53、bcl-2蛋白和P-糖蛋白(P-gp)在人膀胱癌细胞株及其阿霉素(ADM)或足叶乙甙(VP-16)诱导的耐药株中的表达，初步探讨三种蛋白在耐药机制中的作用。

材料和方法

　　一、耐药细胞株培养

　　膀胱癌细胞株BIU-87由北京医科大学泌尿外科研究所惠赠，37℃，5%CO₂中培养，培养液为RPMI1640，含150ml/L小牛血清。培养液中分别加入ADM和VP-16，采用递增药物浓度，ADM、VP-16的浓度分别从0.03mg/L、0.1mg/L递增到0.8mg/L、1.0mg/L，历时10个月，获得两株耐药株BIU-87/A和BIU-87/V，分别能在0.8mg/L、1.0mg/L的ADM或VP-16中稳定生长。通过MTT法测定细胞对药物的耐药倍数。

　　二、免疫组织化学染色

　　P53、bcl-2和P-gp单抗均为Sigma公司产品，采用SABC法进行免疫组化染色，联苯二胺显色，甲基绿液复染。采用CMIAS真彩色医学图像分析系统作图像分析处理。

结　　果

　　经过10个月的诱导，与母代细胞BIU-87相比，BIU-87/A、BIU-87/V耐药株对ADM、VP-16有交叉耐药。BIU-87/A对ADM、VP-16的耐药倍数分别为57.4、59.4；BIU-87/V对ADM、VP-16的耐药倍数分别为6.5、5.4。BIU-87细胞形态呈梭形，大小一致；而BIU-87/A和BIU-87/V形态呈不规则状，细胞内颗粒多于BIU-87细胞，细胞大小不均，体积亦明显大于BIU-87细胞。

　　免疫组化染色，BIU-87细胞P53、bcl-2蛋白和P-gp表达均阴性，而BIU-87/A和BIU-87/V三种蛋白表达均阳性，BIU-87/A的三种蛋白表达量均多于BIU-87/V细胞(附图)，其中Y轴代表阳性颗粒颜色深浅度的相对参数，即吸光度值。P53蛋白阳性染色主要在细胞核上，bcl-2阳性染色位于细胞浆内，P-gp阳性染色位于细胞膜上和细胞浆内。

　　附图　P53、bcl-2和P-gp在BIU-87/A和BIU-87/V细胞中表达

　　 讨　　论

　　化疗药物有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。但是，某些类型肿瘤细胞对化疗存在固有的耐药性，或在治疗过程中获得耐药性，甚至是多药耐药性(MDR)，正是这些细胞造成肿瘤复发。因此，研究细胞对化疗药物耐药性的分子机理，阐明化疗药物如何引起细胞死亡的机制，有助于提高对肿瘤治疗的认识，以取得更好的疗效。

　　最近几年，对细胞程序化死亡或凋亡的探讨和理解，重新考虑了肿瘤细胞获得耐药性的机理。许多毒性刺激能诱导细胞凋亡，即使剂量或浓度不足以引起广泛的细胞代谢障碍^［1］。这些结果提示不同类型的细胞损害，可能产生相同的信号，并诱导细胞凋亡。因此肿瘤细胞对细胞损害和激发凋亡的反应能力可能也参与决定肿瘤治疗的最终效果，故可用一种新的解释来说明肿瘤细胞对化疗药物产生耐受性的机制。

　　野生型P53(wt-P53)基因在细胞生长过程中以“分子警察”身份监视细胞内DNA状态，当DNA受损后，P53通过转录后稳定机制抑制细胞停留在G₁期，使细胞有时间修复，若修复失败，wt-P53将触发细胞凋亡。wt-P53缺乏或发生突变，将失去“分子警察”作用，不能诱导受损细胞凋亡，而使受损细胞得以生存。Lowe等^［2］通过体内实验发现，表达wt-P53基因的肿瘤细胞在经γ射线和ADM治疗后，绝大多数细胞发生凋亡；相反，相同因子治疗P53基因缺陷的肿瘤细胞，细胞继续增殖，仅少数细胞发生凋亡。Lowe等^［1］检测无P53蛋白表达的鼠成纤维细胞MEFS，对放疗和几种化疗药物有较强的耐受性。但将wt-P53基因转染到MEFS细胞，低剂量放疗，或小剂量的ADM、VP-16等药物处理后细胞迅速凋亡。金军等^［3］亦发现wt-P53能促进体外培养的人粘液表皮样癌细胞凋亡。

　　一些研究发现bcl-2基因表达水平升高能显著增加肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的阻抗。Miyashita等^［4］采用基因转染方法，发现与对照组细胞相比，高水平表达bcl-2蛋白的细胞在VP-16和顺铂等化疗药物去除后，能够重新启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。Eliopoulos等^［5］检测P53和bcl-2蛋白在敏感和耐药的卵巢癌细胞株中表达水平，结果显示耐药株过度表达P53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用环节可能在P53之上。而Perego等^［6］检测P53与顺铂导致耐药性间的关系时，发现在卵巢癌耐药细胞株中，突变P53失去激活bax基因转录能力，而后者是一种凋亡启动因子，是一种bcl-2蛋白的异源二聚体，可抵销bcl-2的活性作用。许多临床资料亦发现突变型P53和bcl-2蛋白高表达与不良预后有关。这些资料说明P53、bcl-2和bax等凋亡调节因子在肿瘤细胞的耐药机制中起重要作用。

　　P-gp介导肿瘤细胞产生MDR现象已有较多报道。近来发现突变型P53能激活编码P-gp的MDR1基因的启动子^［7］。Linn等^［8］采用双重免疫染色，核P53聚集和P-gp表达经常发生在同一肿瘤细胞，且这种情况在浸润进展期的乳腺癌中更易见到。推测共同表达突变型P53和P-gp表达属于一系列分子事件，能导致肿瘤浸润、药物耐受，产生不良预后。

　　在本实验中，经过ADM或VP-16数月的诱导，BIU-87/A、BIU-87/V对ADM和VP-16都产生一定的耐受性，且还可能与其它药物有交叉耐药。ADM、VP-16的长期持续作用，可能使BIU-87细胞产生不稳定核型，并诱导细胞基因突变，导致一系列继发性改变。这可以从耐药株细胞形态的改变中反映出来。未经药物作用的敏感细胞株BIU-87，P53、bcl-2蛋白和P-gp表达很低，免疫组化染色阴性；而耐药株三种蛋白表达均阳性，BIU-87/V的三种蛋白表达量少于BIU-87/A，这与后者的耐药性强于BIU-87/V一致。耐药株的P53蛋白应为突变型，因为正常情况下wt-P53的半衰期短，约为20分钟，用一般的免疫组化方法很难检测出，而突变型P53蛋白稳定性增加。因此，一般认为用组织学方法检测出的P53蛋白表达，即表示有P53基因突变。P53基因突变和bcl-2蛋白、P-gp表达增强可能都参与了BIU-87/A和BIU-87/V产生耐药性的机制，三者之间可能有一定关联。

　　由突变型P53和bcl-2蛋白介导的耐药机制不同于由P-gp等介导的经典耐药机制，耐药谱也可以不同于P-gp等介导的耐药谱，这充分说明了耐药性产生的复杂性和多样性。临床上要克服肿瘤细胞的耐药性，必须首先确定该细胞的耐药机制。因此，在肿瘤细胞耐药性研究中，应从多角度、全方位考虑，才能制定出较好的治疗方案。另外，对凋亡调节因子介导耐药性机制的研究，可通过加强诱导细胞凋亡的途径克服耐药性，同时可以为恶性肿瘤的基因治疗提供一些实验依据。

　　参考文献

　　1　Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.P53-Dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993,74∶957-967.

　　2　Lowe SW,Bobis,S,McClatchey A,et al.P53 status and efficacy of cancer therapy in vivo.Science,1994,266∶807-810.

　　3　金军，张盈华，唐文杰，等.阿霉素诱导人粘液表皮样癌细胞凋亡和P53蛋白表达的研究.肿瘤，1996，16∶388-389.

　　4　Miyashita T,Reed JC.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line.Blood,1993,81∶151-157.

　　5　Eliopoulos AG,Kerr DJ,Herod J,et al.The control of apoptosis and drug resistance in ovarian cancer:influence of P53 and bcl-2.Oncogene,1995,1∶1217-1221.

　　6　Perego P,Giarola M,Righetti SC,et al.Association between cisplatin resistance and mutation of P53 gene and reduced bax expression in ovarian carcinom a cell system.Cancer Res,1996,56∶556-562.

　　7　Chin KV,Ueda K,Pastan I,et al.Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by ras and P53.Science,1992,255∶459-462.

　　8　Linn SC,Honkoop AH,Hoekman K,et al.P53 and p-glycoprotein are often co-expressed　are　associated　with poor prognosis in breast cancer.Br J Cancer,1996,74∶63-68.

(收稿：1997-11-03　修回：1998-02-25)