高复发及浸润性膀胱癌的分子生物学基础

中华泌尿外科杂志 1999年第9期第20卷 论著

作者：郭德荣　顾方六　蔡碧娟　周爱儒

单位：郭德荣　顾方六　蔡碧娟（100034 北京医科大学泌尿外科研究所）；周爱儒（北京医科大学生化教研室）；郭德荣（现在珠海市人民医院泌尿外科）

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；基因

　　【摘要】　目的　探讨膀胱癌多发，复发和浸润的分子生物学基础。　方法　采用分子生物学方法对膀胱癌实体肿瘤TGFα，EGFR，p16和p53基因表达、缺失及生物学意义进行了研究。　结果　34例膀胱癌中 85％ (29/34) TGFα mRNA 阳性表达，肿瘤的表达量是癌旁正常对照的2～5倍, P＜0.01。膀胱癌EGFR mRNA表达率为44%（4/9）。50例膀胱癌p53蛋白免疫组化阳性核染率42%(21/50 )，其中PT₃ 82%(9/11)，G₃ 72% (13/17)，PT₂ 40% (12/30)，G₂ 32% (8/25)，PT₁和G₁级肿瘤未见阳性核染。随访25例，p53阳性核染者中76%(10/13)有复发转移。20%(2/10)实体膀胱癌有p16基因的丢失。结论　 TGFα mRNA 高表达可能是膀胱癌发生的早期事件。EGFR和p53 基因异常表达可能与膀胱癌的分化和恶性度相关。

A study of gene alteration and its biological significance on the invasiveness and recurrency of bladder cancer

GUO Derong,GU Fangliu,CAI Bijuan,et al.Institute of Urology,

　　Beijing Medical University,Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To investigate the cause of multiplicity,recurrency and invasiveness of bladder cancer on biological basis.　Methods　The expression or deletion of TGF,EGFR,p16 and p53 were stu-died in the tumor mass of bladder cancer and their biological significance was probed into.　Results　TGFα mRNA was positively expressed in 29 of the 34 bladder cancer (85%) and quantitatively being 2～5 times of that in the para-cancer tissues (P＜0.01).EGFR mRNA was positively expressed in 4 of 9 (44%).In 50 cases of bladder cancer,the nuclear staining rate of p53 protein by means of immunohistochemical technique was 42% (21/50),among which PT₃ being 82% (9/11),G₃ 72%(13/17),PT₂ 40%(12/30) and G₂ 32% (8/25).No nuclear staining has been observed in PT₁ and G₁ tumors.25 patients have been followed up.Recurrence and metastasis occurred in 10 of 13 patients with positive p53 nuclear staining.In 2 of 10 cases,there was deletion of p16 in the tumor mass of the bladder cancer.　Conclusions 　High TGFα mRNA expression might be an early event in the development of bladder cancer while abnormal expression of EGFR and p53 genes might be related to the differentiation and malignancy of bladder cancer.

　　【Keywords】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Genes

　　采用分子生物学方法对膀胱癌相关基因进行了研究，探讨高复发及浸润性膀胱癌的分子生物学基础, 报告如下。

　　材料和方法

　　一、肿瘤组织的来源和储存

　　膀胱癌标本来源于北京医科大学第一、第三临床医院和北京友谊医院。手术中切除的癌组织和癌旁组织离体后立刻放入液氮中储存备用，全部标本均经病理得到证实。

　　二、探针

　　TGFα探针为0.9kb EcoRI酶切回收的cDNA探针。EGFR为1.8kb cDNA探针,由北京医科大学肿瘤研究所提供。p53探针为1.8kb cDNA探针,华美公司提供。p16探针为自行制备^［1］。

　　三、方法

　　PCR、Southern、Northern杂交( DNA、RNA的提取、酶切和杂交及探针扩增均按常规操作进行)和ABC免疫组化方法详见参考文献［1-4］。

　　四、统计学处理^［2，4］

　　p53免疫组化和TGFαmRNA Northern杂交两组较大样本，进行了统计学处理^［2，4］。

　　结　果

　　34例膀胱癌患者中29例TGFα mRNA阳性表达，表达率为 85％(29/34)；13例癌旁对照组织中，6例无表达，6例低表达，1例高于自身肿瘤表达。肿瘤的表达量是癌旁正常对照的2～5倍，经统计学分析，P＜0.01。但表达量与肿瘤分期和分级差异无显著性，P＞0.05。

　　EGFR mRNA研究结果：9例膀胱癌中4例高表达者均为G₂，G₃肿瘤。其中腺癌2例，鳞癌1例，移行细胞癌1例。

　　50例膀胱癌p53蛋白免疫组化、病例随访和统计学分析的研究结果：膀胱癌阳性核染率为 42% (21/50)，其中 PT₃ 82% (9/11) ， G₃ 72% (13/17)，PT₂ 40% (12/30)，G₂ 32%(8/25)，PTa、PT₁和 G₁肿瘤未见阳性核染。随访25例，13例p53阳性核染者中76%(10/13)有复发和转移。单纯复发者只占23%(3/13)。13例阳性核染者平均存活时间22.6个月，12例p53阴性核染者，平均存活时间63.7个月，P＜0.01。

　　20个膀胱癌及其癌旁组织样品提取的DNA经EcoRI酶切后与 p16外显子2探针行Southern杂交。10例正常组织和8例膀胱癌样品显示6.6kb和 4.4kb两条杂交带，20%(2/10)的肿瘤发现杂交带的丢失。这种杂交带的消失,我们视为纯合子丢失。

　　讨　论

　　一、 膀胱癌原癌基因的激活或变异

　　本组实验结果证实34 例膀胱癌患者中，29例 TGFα mRNA 阳性表达，表达率为 85％。肿瘤的表达量是癌旁正常对照的2～5倍，差异有显著性。膀胱癌 EGFR mRNA 表达率为44%（4/9）， 4 例高表达者均为G₂、G₃ 级肿瘤。Hennifer等^［5］报道24例头颈癌患者，95%癌旁组织(组织细胞形态虽未发生恶变，但已受到致癌因素的作用，如长期大量的吸烟和饮酒)和 87.5%癌瘤组织与完全正常组织相比， TGFα mRNA表达量前者是后者的5倍，统计分析P=0.001。91%的癌旁组织和92%癌瘤组织分别是完全正常组织的EGFR mRNA表达量的29倍和69倍。认为TGFα和EGFR的高表达与致癌物作用有关,是癌瘤发生的早期信号。TGFα具有使正常细胞转化为恶性细胞的能力，而EGFR是TGFα作用的靶蛋白，EGFR在TGFα作用下，细胞恶性增殖的信号向细胞内传导开始。此外，EGFR基础研究表明： 2个EGFR的磷酸化位点剪切后，可使正常的红细胞向幼稚型红细胞转化，更多的EGFR磷酸化位点被剪切后形成血癌^［6］。目前已有许多实验表明，EGFR不但参与正常细胞的转化，而且与膀胱癌的恶性表型相关，我们的实验结果也支持这种观点。

　　二、抗癌基因的变异或丢失

　　在十几种抗癌基因研究中，比较明确与膀胱癌相关的抗癌基因有p53、 Rb、 p16和nm23基因。本组原发膀胱癌中发现20%（2/10）有p16基因纯合子的丢失。Spruck等^［7］通过PCR和Southern blot的方法，对膀胱癌和膀胱癌细胞株进行研究，有19%的原发膀胱癌和54%的膀胱癌细胞株有p16基因的丢失。Cairns等^［8］的研究结论是膀胱癌、头颈癌、肺癌和脑瘤p16基因的丢失率为10%～20% 。Kamb等^［9］对原发膀胱癌和膀胱癌细胞株的研究认为p16基因的变异率为56% (包括突变和基因纯合子丢失)。本实验结果与国外报道大体相同。

　　膀胱癌免疫组化研究表明：p53阳性核染与生存概率有明显相关性P＜0.01。Spruck等^［10］检测分析膀胱癌分期分级和p53突变的关系，1/36个Ta期膀胱癌有p53突变，32% T₁期膀胱癌 p53突变，而晚期膀胱癌和原位癌p53突变率在 51%和 65%，其中65%的p53突变的原位癌中有 27%同时发现存在17p LOH。Sidromsky等^［11］在18个膀胱肿瘤样品中发现 11个有p53基因突变， 11个突变样品中有 10个存在 17p LOH。这些研究结果表明，p53突变早于17p等位基因的丢失。

　　癌基因的激活和抗癌基因的失活或变异是同时发生的还是顺序发生的目前尚不清楚。从以往的研究结果看，p53、Rb基因突变和丢失似乎是膀胱癌的晚期事件，而且都与膀胱癌的恶性表型相关。Omum等^［12］通过 PCR-RFLP发现60%浸润性膀胱癌有 17p丢失，由于低级和高分级膀胱癌发现都有 9号染色体（9p21-22为 p16和 p15的基因位点，9q12-34为其它抗癌基因的基因位点）丢失，而浸润性膀胱癌发现仅有17号染色体短臂基因（p53基因）突变，因此提出 9号染色体的丢失是膀胱癌发生发展的早期事件，而 p53突变是膀胱癌的晚期事件。由此推测 9号染色体主要引发癌细胞增殖，而 p53则主要是与细胞恶性表型相关。最近研究表明：65%Cis（原位癌)发现 p53基因的突变，而在浸润性膀胱癌第 9号染色体的丢失率却少于 p53突变率，虽然 Cis是一种非浸润性膀胱癌，但是在临床上大约 80%病人发展为浸润性膀胱癌。因而认为是p53突变的结果^［13］。

　　膀胱癌在形成过程中，是多基因顺序作用的结果，原癌基因的激活和作用常常是协同促癌的。例如，膀胱癌的重要癌基因 H-ras和 myc基因，它们彼此单独并不能使胚胎细胞发生转化。如果它们同时作用就会使成纤维母细胞转化成肿瘤细胞。膀胱癌原癌基因、抗癌基因和转化生长因子及受体从某一个侧面反映了在膀胱癌形成过程中，可能有TGFα，EGFR的过度表达，Cerb-B₁，Cerb-B₂的剪切表达，有ras，myc多种癌基因的变异或激活，有Rb 、p53、p16 抗癌基因的突变和丢失。由于各种致癌因素的不同，作用环节不同，诱发不同的基因变异，所以膀胱癌生物习性也不同。

　　现代分子生物学技术的进步，使我们能够窥测到膀胱癌细胞内分子基因的变异。近几年我们的研究结果证实，TGFα高表达是膀胱癌发生的早期基因变异，其他学者证实 9号染色体的丢失与膀胱乳头状瘤有密切关系，我们的 p16研究结果也提供膀胱癌第 9号染色体的丢失证据。综上所述，膀胱癌早期癌基因激活可能是 TGFα和EGFR，浅表膀胱癌发生的第一个抗癌基因的丢失可能是第9号染色体，随后出现11p,3p,p53和 Rb基因变异丢失，临床表现为浸润性膀胱癌。膀胱上皮表层GAG的破坏或组成成分的改变，促使膀胱移行上皮发育不良^［14］，导致 p53突变和 Cis发生，继之其它抗癌基因变异，形成浸润性膀胱癌。在这种突发事件中，p53是首发变异基因，故Cis显示有更大浸润性特征。

　　本课题受卫生部科学研究基金资助(1272302)

　　参考文献

　　1　郭德荣，顾方六，周爱儒，等. p16基因在膀胱癌和尿生殖癌细胞株中的丢失 .中华外科杂志 , 1996,34∶643-644.

　　2　郭德荣, 顾方六, 周爱儒. p53基因在膀胱癌中表达的临床意义.中华泌尿外科杂志, 1994 ,15∶113-115.

　　3　郭德荣, 顾方六, 周爱儒, 等. 转化生长因子和表皮生长因子受体在膀胱癌中的表达 . 中华泌尿外科杂志, 1995,16∶80-83.

　　4　郭德荣, 李鸣, 顾方六, 等. 膀胱癌转化生长因子α和p53基因表达及生物学意义 .中华泌尿外科杂志 , 1996, 17∶67-68.

　　5　Hennifer RG , Tweardy DJ. Elevated levels of transforming growth factor and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Res, 1993, 53∶3579-3583.

　　6　Aronson SA. Growth factor and cancer. Science, 1991,254∶1146-1149.

　　7　Spruck CH, Gonzalez ZM, Shibata A, et al. Rates of p16 gene in uncultured tumors. Nature, 1994,307∶183-184.

　　8　Cairns P, Mao Li, Merlo A, et al. Rates of p16 mutation in primary tumors with 9p loss. Science, 1994,265∶415-417.

　　9　Kamb A, Liu Qingyun, Harshman K, et al. Rates of p16 mutation in primary tumors with 9p loss (technical comments). Science, 1994,265∶416.

　　10　Spuck CH III, Ohneseit PF, Gonzalez Z, et al. Two molecular pathways to transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer Res. 1994, 54∶118-121.

　　11　Sidransky D, Frost P. Clonal origin of bladder cancer. N Engl J Med. 1992, 326∶737-740.

　　12　Omum AF, Tsai YC, Nichols PW, et al. Allelic loss of chromosome 17p distinguishes high grade from low-grade transtional cell cancinoma of bladder. Cancer Res, 1990, 50∶7981-7985.

　　13　Anderson CK . Current topics on the pathology of bladder cancer . Proc R Soc Med, 1993, 66∶283-285.

　　14　Nickel JC, Comish J. Ultrastructural study of antibody-stabilized bladder surface∶ a new perspective on the elusive glycosaminoglycan layer. Urology, 1994, 12∶11-15.

(收稿：1998-11-13　修回：1999-03-29)