确定叶酸缺乏有下列几种方法：
(1)血清叶酸测定 常用的测定方法有两种。
①微生物学测定法：其原理与维生素B12的微生物学测定法相仿，所用细菌是干酪乳酸杆菌，在不同的试管中加入不同浓度的叶酸，待细菌生长后在规定的培养时间测定各管的光密度，以此绘制成不同浓度叶酸的标准曲线。将受检的血清标本作为叶酸来源，加入同样的培养基和干酪乳酸杆菌，在同样的试管中培养后，测定其光密度，与标准曲线比较，即可测出标本中的叶酸浓度。血清叶酸<3ng/ml，常表示有叶酸缺乏并有临床表现；3～6ng/ml 常常没有临床和血液形态学改变，但可能是叶酸缺乏的早期表现。
②放射性同位素测定法：所得结果与微生物学测定法相同。它的优点是结果更准确，更快捷，且不受血清中叶酸拮抗物或抗生素的影响，唯操作方法稍复杂。
(2)红细胞叶酸测定
红细胞内所含叶酸的浓度比血清高10～20倍。当组织内叶酸已缺乏但尚未出现巨幼红细胞贫血时，红细胞叶酸的测定对叶酸缺乏作出诊断尤其有价值。测定的方法即将血清叶酸的测定方法稍加改变。正常值为160～640μg/L。叶酸缺乏时可低于正常值；但在维生素B12缺乏时，红细胞叶酸含量亦可低于正常。
(3)亚胺甲基谷氨酸(FIGLU)排泄试验
叶酸缺乏时，组氨酸转变为谷氨酸的过程受到干扰，其代谢中间产物FIGLU的产生增加并从尿内大量排出。受试者在试验前先口服组氨酸20克。正常人服组氨酸后，尿中没有或极少有 FIGLU；叶酸缺乏时有大量FIGLU排出。如果巨幼细胞贫血患者的检查结果阴性，对排除叶酸缺乏所致很有价值。
(4)叶酸吸收试验
其原理与放射性维生素B12吸收试验相仿，目的是衡量患者对叶酸的吸收是否正常。以3H为标记的叶酸40μg/kg，一次口服，随即注射无同位素标记的叶酸15mg，然后测定尿的放射叶酸剂量。正常人从尿内排出口服放射性叶酸剂量的32%～41%，排出量<26%表示肠道对叶酸的吸收有障碍。
(5)叶酸治疗性试验
用“生理性”小剂量叶酸每日0.2mg治疗，如果贫血是叶酸缺乏引起的，用药后即可观察到临床症状、血象和骨髓象的进步。如果贫血是维生素B12缺乏引起的，用较大剂量的叶酸每日5mg，病情也能改善，但用上述“生理性”小剂量治疗则无效。可见，此方法不但对叶酸缺乏的诊断有价值，而且可与维生素B12缺乏作出鉴别。作此试验时，应注意限制饮食中含有叶酸的食品，因为叶酸缺乏的病人与恶性贫血病人不同，能从食物中摄取所缺的叶酸而使症状及血象好转。
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