肺炎衣原体与冠心病发病的关系

心血管康复医学杂志 1999年第3期第8卷 科研报告与经验交流

作者：吴青平　邓水泉　李　雯　杨政坚

单位：吴青平　邓水泉　李雯　福建省三明市第一医院，三明市，365000；杨政坚　福建省三明市卫生局

　　肺炎衣原体(Chlamydia Pneumoniae Cpn)是Gvany Sten 1983年从急性呼吸道患者的咽部中分离出来的衣原体属中的一个新种，是近年来发现的一种新的人类急性呼吸道感染的重要致病菌。有关文献报道：Cpn不但常引起肺炎、支气管炎，而且可能与心肌炎、冠心病、急性心肌梗塞及结节病发病有关。肺炎衣原体慢性感染可能是冠心病病因之一。因为在这些患者中也发现较高的衣原体抗体水平。由于肺炎衣原体有严格的细胞内寄生特点，只能在活细胞内生长繁殖，故分离培养方法复杂，所需时间长，不便于临床快速诊断。为探讨肺炎衣原体与心血管疾病中的冠心病发病的关系，我们采用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术检测冠心病人的咽拭标本中的肺炎衣原体，现将结果报告如下：

　　1　资料与方法

　　1.1　检测对象

　　为我院心血管内科的住院冠心病病人，其中男19例，女12例，年龄48～76岁。

　　1.2　方法

　　1.2.1　试剂、仪器与标本

　　试剂来源：由江苏省无锡市克隆遗传技术研究所提供。仪器：采用美国PE公司的DNA-Thermal Cycler。标本采集：将棉拭子于咽部旋转360°采样后，置入含1ml生理盐水的离心管内洗涤，挤干，弃拭子。将标本液作及时处理或置入4℃冰箱等候处理。

　　1.2.2　模板制作：将1ml标本液离心10000rpm5分钟，吸弃上清液，加入裂解液A50ml，取裂解液2ml混匀，置55℃浴1小时后转入100℃沸水浴5分钟，离心1500rpm 30秒，上清液5μl作为第一次扩增的模板。

　　1.2.3　聚合酶链反应(PCR)扩增：①第一次PCR扩增：按试剂说明于每只标本管中分别加入PCR反应液，置DNA热循环扩增仪上93℃预变性2分钟，93℃30秒55℃30秒72℃60秒，循环35个周期，72℃延长5分钟。扩增完毕，每管加入H₂O 200μl混匀，取5μl为第二次扩增模板；②第二次PCR扩增：按试剂说明配制PCR反应体系，加入第二次扩增模板5μl，置DNA Thermal Cycer仪上扩增，93℃预变性2分钟，93℃30秒55℃30秒72℃60秒，循环35个周期，最后72℃延长5分钟。

　　1.2.4　电泳观察结果：取第二次扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀，点样于2%琼脂糖凝胶(内含溴乙锭)，100V电泳30分钟后在紫外线分析仪上观察结果，出现210bp萤光者即为Cpn阳性。

　　2　结果

　　在31例临床诊断为冠心病的患者中，巢式聚合酶链反应检测肺衣原体(Cpn-DNA)，3例为阳性，阳性率为9.6%，正常对照组的检出结果均为阴性。见表1。

　　3　讨论

　　近年来，国内外有学者在肺炎衣原体与各种疾病关系方面作了不少研究。Grayston JT等证实肺炎衣原体与心血管疾病的发生有关。芬兰最早通过血清流行病学调查发现，肺炎衣原体抗体与冠心病和急性心肌梗塞密切相关，美国也相继发现血清中的肺炎衣原体与经血管造影证实的冠心病和经超声证实的颈动脉病关系密切。近来在冠状动脉和主动脉的硬化斑中，用肺炎衣原体特异性单克隆抗体作免疫组织化学染色和以PCR检测肺炎衣原体的DNA均证实病灶中存在肺炎衣原体，而正常动脉组织则阴性，同时，硬化的冠状动脉壁在电镜下还观察到大小和形态均与肺炎衣原体相似的梨形结构，由此，这些研究清楚表明，肺炎衣原体与动脉硬化斑相关。

表1　巢式聚合酶链反应检测咽找标本Cpn-DNA结果

　　本组结果表明冠心病人咽拭标本的肺炎衣原体阳性检出率为9.6%，与其他学者应用血清学抗体的方法或单克隆抗体免疫组化染色结果有所不同，他们阳性检出率约35%～40%，是否与取材部位、检测方法不同以及本组研究病例数不多有关，有待进一步研究。