脑梗死、冠心病患者载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点多态性研究

中国动脉硬化杂志 2000年第3期第8卷 实验研究

作者：顾云　王绿娅　吴桂贤　王薇　秦兰平　刘军　吴兆苏

关键词：载脂蛋白AI；基因；多态性；血脂；冠状动脉疾病；脑梗死

　　［摘　要］　为了观察载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点多态性在北京地区汉族人群冠心病患者和脑梗死患者中的分布特点，探讨其与脂质代谢的关系，采用聚合酶链反应扩增技术对783例个体载脂蛋白AI基因型进行分析，其中脑梗死组236例，冠心病组226例，对照组321例，同时测定血脂及载脂蛋白。结果显示载脂蛋白AI基因第三内含子M₂等位基因频率与冠心病密切相关。M₂等位基因频率为0.387，与对照组相比增加(P＜0.05)；M₂等位基因频率脑梗死组与对照组相比有所增加，但统计学上未见差异(P＞0.05)。M₂M₂纯合等位基因型组的血脂变量与M₁M₁及M₁M₂等位基因型组比较无论是在对照组还是在冠心病、脑梗死组中均存在显著差异。提示载脂蛋白AI基因第三内含子M₂等位基因的检出为进一步揭示该基因在冠心病发病及冠心病、脑梗死脂质代谢中的作用提供了良好的遗传标记，对预测血脂相关性疾病的危险性具有重要意义。

　　［中图分类号］　Q754　　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］　1007-3949(2000)-03-0209-04

Association of Polymorphisms of the Apolipoprotein AI Gene with Coronary Heart Disease and Atherosclerotic Cerebral Infarction Patients

GU Yun，WANG Lu-Ya，WU Gui-Xian，WANG Wei，QIN Lan-Ping，LUI Jun，WU Zhao-Su

　　(Medical Institute of Beijing Heart Lung and Blood Vessel, Beijing 100029, China)

　　ABSTRACT　　Aim　 To investigated the polymorphisms of the apolipoprotein AI(apoAI) gene with coronary heart disease (CHD) and atherosclerotic cerebral infarction (ACI) patients in Beijing area.　And to evaluate the association of polymorphisms of MspI with variable of lipid.　　Methods 　Using the polymerase chain reaction (PCR), We studied the polymorphism of MspI in 226 patients with CHD and 236 patients with ACI and 321 age-matched healthy individuals.　　Results　 The polymorphic site was the MspI site in the third intron of apoAI gene, whose presence has previously been shown to be associated with CHD.　 The frequencies of the MspI minor allele M₂ were 0.387 in CHD patients (P＜0.05).　There were no difference in the frequencies of minor allele M₂ between ACI patients and controls (P＞0.05).　There were apparent differences in the genotypes of apoAI gene and several lipid variables among the CHD patients， ACI patients and control group.　　Conclusions　 M₂ allele in the third intron of the apoAI gene may associated with CHD and ACI and presumably through its influences on lipid metabolism to increase the susceptibility to atherosclerosis disease.

　　MeSH 　　Apolipoprotein AI;　Gene; 　 Polymophisms;　Lipids;　Coronary Artery Disease;　Cerebral Infarction

　　国内外有学者开展血浆中载脂蛋白AI基因多态性与动脉粥样硬化、冠心病(coronary heart disease,CHD)和心肌梗死等疾病关系的研究，但载脂蛋白AI基因与动脉粥样硬化性脑梗死 (atherosclerotic cerebral infarction,ACI)的关系尚少见报道。Qing等^［1］研究发现载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点多态性与日本西部高甘油三酯血症人群密切相关。我们也对载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点多态性在北京地区汉族人群冠心病及脑梗死患者中的分布特点及其与血脂表现型的关系进行了研究，以期了解该基因 MspI位点多态性与动脉粥样硬化性心脑血管病的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　对照组321例，按照WHO MONICA方案危险因素调查标准^［2］从随机调查样本中选择体检健康人，血脂正常，排除心脑血管病、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病。其中男性218例，女性103例，平均年龄48.8±11.4岁。

　　冠心病组226例，其中男性184例，女性42例，平均年龄52.1±10.2岁(均符合世界卫生组织冠心病诊断标准^［3］）。

　　脑梗死组236例，其中男性166例，女性70例，平均年龄53.0±14.0岁(全国第二届脑血管学术会议修订的脑血管病诊断标准^［4］)。

　　1.2　血浆脂类检测

　　空腹12～14 h后，周围静脉取血5 mL，用2%乙二胺四乙酸(ethylene diamina tetraecetic acid, EDTA)1∶9 抗凝，室温下离心10 min，取上层血浆用来测定血清中脂质及载脂蛋白，血细胞用于提取染色体DNA。胆固醇(total cholesterol, TC)和甘油三酯(triglyceride, TG)采用氧化酶法测定；高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDLC)用磷钨酸镁法；低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)采用Friedewald公式计算；载脂蛋白AI和载脂蛋白B100采用透射免疫比浊法。

　　1.3　DNA提取及扩增

　　将抗凝血低渗溶血，高盐提取方法提取白细胞基因组DNA。采用PCR技术特异性扩增载脂蛋白AI 基因第三内含子MspI多态性位点。引物参照文献［1］设计，序列为5’-CAGCGGCAGAGACTATGTGT-3’， 5'-CGTTGTGCAGTGGACCGA-3’。 PCR扩增反应体系为25 μL，含有0.5～1.0 μg基因组DNA、2.5 mmol/L MgCl₂、100 μmol/L dNTPs、1.0 u Taq DNA聚合酶和20 pmol/L引物以及反应缓冲液，加20～30　μL液体石蜡。扩增温控条件：变性96℃ 30 s；退火58℃ 1 min，延伸72℃ 3 min，共30个循环。

　　1．4　载脂蛋白AI基因第三内含子MspI等位基因限制性片段长度多态性检测

　　将MspI限制性内切酶24 u及3 μL 10×缓冲液加入15 μL的DNA扩增产物中(扩增产物为493 bp)，终反应体积为30 μL。反应混合物于37℃恒温过夜。载脂蛋白AI基因第三内含子MspI多态性是由于限制性酶切位点的存在或缺如而形成的。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，得到303 bp和190 bp两个片段，即为M₁等位基因，酶切位点缺失则为M₂等位基因。

　　载脂蛋白AI的基因图(图1， Figure 1)显示了MspI多态性位点，相应的缓冲液由Promaga公司生产。

图1　载脂蛋白AI基因图.　M^＋显示MspI内切位点

　　Figure 1　The polymorphic site of the MspI in the third intron of apoAI gene

　　1.5　统计分析

　　统计分析用SPSS软件包。组间等位基因频率差异用χ²检验。对不同基因型亚组间血脂和载脂蛋白水平的差异分别用t检验及单因素方差分析。

　　2　结 果

　　2.1　血浆脂质及载脂蛋白水平比较

　　从表1(Table 1)可见，冠心病组和脑梗死组与对照组比较，胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白B升高(P＜0.001)，高密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白AI降低(P＜0.001)，载脂蛋白AI与B100比值下降(P＜0.001)。

表1　对照组与冠心病组和脑梗死组血浆脂质及载脂蛋白水平比较

　　Table 1　Comparison of serum lipids levels between control group and CHD, ACI group(±s)

　　a: P＜0.05； b: P＜0.001, compared with control group.

　　2.2　载脂蛋白AI基因第三内含子MspI等位基因频率分布比较

　　从表2(Table　2)可见，对照组中M₂等位基因频率为0.335，而冠心病组中M₂等位基因频率为0.387，与对照组比较差异具有显著性(P＜0.05)；脑梗死组中M₂等位基因频率为0.352，与对照组比较虽有所增加但统计学上无明显差异(P＞0.05)。

表2　北京地区汉族人群载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点多态性频率分布

　　Table 2　Genotype distribution and allele frequencies for the apoAI polymorphisms in diseases and control group

　　a： OR=0.80, χ²=5.64, P＜0.05; b： OR=1.40, χ²=8.75, p＜0.01; c： OR=0.08, χ²=5.86, P＜0.052.3　MspI多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系

　　冠心病组中的M₂M₂纯合子等位基因型组甘油三酯及载脂蛋白B血浆浓度较M₁M₁纯合子及M₁M₂杂合子基因型组显著升高(P＜0.05)，而载脂蛋白AI与B比值较其他两基因型组显著降低(P＜0.05)(表3，Table　3)。

　　脑梗死组中的M₂M₂纯合子等位基因型组甘油三酯血浆浓度较M₁M₁纯合子及M₁M₂杂合子基因型组显著升高(P＜0.05)，而血浆载脂蛋白AI浓度、载脂蛋白AI与B比值较其他两基因型组显著降低(P＜0.001)。

　　对照组中M₂M₂纯合子等位基因型组甘油三酯血浆浓度较M₁M₁纯合子及M₁M₂杂合子基因型组显著升高(P＜0.05)。

表3　冠心病组、脑梗死组及对照组中载脂蛋白AI基因多态性与血浆脂质及载脂蛋白的关系

　　Table 3　Comparison of different apoAI MspI genotypes with serum lipids level in control group, CHD and ACI group(±s)

　　a: P＜0.05, b: P＜0.001, Compared with control group。3　讨　论

　　载脂蛋白AI是高密度脂蛋白的主要载脂蛋白，约占其总蛋白的60％～70%，载脂蛋白AI也是高密度脂蛋白代谢中的一个重要的酶——卵磷脂胆固醇酰基转移酶的激活物。它能促进主动脉成纤维细胞中游离胆固醇的清除，酯化周围组织中的游离胆固醇并将其转入肝内代谢，参与胆固醇的逆向运转过程，这对防止外周组织脂质沉积引起的粥样硬化有重要意义。因而，载脂蛋白AI对体内脂类转运和代谢以及维持体内恒定的血脂水平起到重要作用。由于载脂蛋白AI对含载脂蛋白AI脂蛋白的组装、分泌和分解过程至关重要，故其基因变异可能导致血浆中这些脂蛋白数量和性质的变化，从而引发某些疾病。

　　载脂蛋白AI基因位于第11号染色体长臂，由4个外显子和3个内含子组成，与载脂蛋白CⅢ及载脂蛋白AⅣ基因紧密相邻，载脂蛋白AI第三内含子长588 bp，在编码成熟载脂蛋白AI第40号氨基酸残基的密码处插入，5’端均为GT，3’端为AG。

　　本实验研究结果表明冠心病组中M₂等位基因频率为0.387(P＜0.05)，而脑梗死组中M₂等位基因频率为0.352，与对照组比较有增加的趋势，但统计学上未见明显差异。在载脂蛋白AI基因第三内含子MspI位点不同基因型与血脂变量是否相关的研究中发现，不论是在冠心病组、脑梗死组或是在对照组中，不同基因型组的血脂和载脂蛋白水平均有不同程度的改变。

　　载脂蛋白AI基因M₂M₂等位基因的检出为进一步揭示载脂蛋白AI基因在冠心病的发病及冠心病和动脉粥样硬化性脑梗死脂质代谢中的作用提供了良好的遗传标记。具有M₂M₂纯合子等位基因型者较具有M₁M₁及M₁M₂等位基因型者有易患血脂异常性疾病的倾向，载脂蛋白AI基因M₂M₂等位基因的检出对预测血脂相关性疾病危险因素可能具有重要意义。

　　致　谢　　感谢中国医学科学院基础医学研究所陈保生教授及薛红老师的热情帮助。

　　［基金项目］　北京市自然科学基金资助项目(7952004)

　　［作者简介］　顾云，女，1960年出生，副研究员，从事病理生理研究。吴兆苏，男，1942年出生，研究员，从事流行病学研究。

　　参考文献

　　［1］　Qing Z, Marilyn D, Yoichi T, et al.　An apolipoprotein CⅢ marker associated with hypertriglyceridemia in Caucasianese population ［J］.　Hum Genet,　1995，　95:　371-375

　　［2］　吴兆苏， 姚崇华， 赵　冬， 等.　我国多省市心血管病趋势及决定因素的人群监测(中国MONICA方案)I．发病率和死亡率监测结果 ［J］.　中华心血管病杂志，　1997，　25(1)： 6-11

　　［3］　Nomenclature and Criteria for Diagnosis of Ischenic Heart Disease.　Report of the joint international society and federation of caridiology/WHO task force on standardization of clinical nomenclature ［J］.　Circulation,　1979,　59:　607-609

　　［4］　王新德．　各类脑血管疾病诊断要点 ［J］.　中华神经精神科杂志，　1988，　21：　60

(此文2000-02-18收到，2000-06-20修回)