儿童急性白血病p16基因的缺失和突变及其意义

中华儿科杂志 2000年第5期第38卷 论著

作者：段渊　胡亚美　崔建涛　赵敏　吕有勇

单位：段渊(100045　首都医科大学附属北京儿童医院血液病中心)；胡亚美(100045　首都医科大学附属北京儿童医院血液病中心)；崔建涛(北京市肿瘤研究所)；赵敏(北京市肿瘤研究所)；吕有勇(北京市肿瘤研究所)

关键词：白血病；基因缺失；基因，p16；突变

　　【摘要】　目的　探讨p16基因缺失、突变在儿童急性白血病发病中的意义。方法　选择白血病初治患儿51例，取其骨髓或外周血标本抽提DNA，进行差异聚合酶链反应(D-PCR)和单链构象多态性聚合酶链反应（SSCP-PCR）的检测。结果　（1）儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）p16基因外显子1、外显子2和外显子3的缺失率分别为32%(12/38)、44%(17/39)和29%(12/42)。（2）无一例发生基因突变。（3）急性非淋巴细胞性白血病8例中无一例发生缺失。结论　儿童急性白血病p16基因缺失率高，以T-ALL的p16基因缺失率为最高。认为p16基因缺失在白血病发生中有一定意义。

The significance of p16 gene deletions and mutations in children with acute leukemia

DUAN Yuan^*, HU Yamei, CUI Jiantao, et al.

　　^* Department of Hematology, Beijing Children's Hospital Offiliated to Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045, China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the significance of homozygous deletions and mutations of p16 gene in the pathogenesis of acute leukemia (AL). Methods　DNA was extracted from peripheral blood and bone marrow mononuclear cells of 51 patients with untreated AL. The differentiation polymerase chain reactions (D-PCR) as well as single-strand conformation polymorphism (SSCP) were applied. Results　(1) The homozygous deletion rates at exon 1, exon 2 and exon 3 in p16 gene were 32% (12 of 38 cases), 44% (17 of 39 cases) and 29% (12 of 42 cases), respectively. (2) No mutation was detected by SSCP-PCR method. Conclusion　The characteristics of the p16 gene deletions were: more frequent deletions, especially in T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) children, in whom the highest deletion rate was found; no mutation in acute non-lymphoblastic leukemia (ANLL) children.

　　【Key words】　Leukemia;　Genes deletion;　Genes, p16;　Mutation

　　肿瘤是在多因素、多途径、多步骤的反复作用下发生的，其中癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活起重要作用。我们应用简便可靠的差异聚合酶链反应(differential-PCR，D-PCR)法对51例初诊白血病患儿进行了p16基因的检测。旨在探讨p16基因在肿瘤发病中的作用。

　　对象和方法

　　一、对象

　　选择我院初治急性白血病（AL）患儿51例。其中，T-ALL 6例；普通型ALL 30例；前B型ALL 2例；早期前B型ALL 2 例；B-ALL 3 例；急性非淋巴细胞白血病(ANLL) 8例。标本采自患儿骨髓或外周血(幼稚细胞＞70%)。经肝素抗凝后低温保存(-70℃)。

　　二、方法

　　1.主要试剂和设备：（1）主要工具酶、试剂：Taq DNA聚合酶（Boehringer公司）；蛋白酶K（Sigma公司）；RnaseA（BMB公司）；DNA Marker：λDNA/HindⅢ、PUC18/HaeⅢ(0.1 μg/μl)。（2）主要仪器设备：PCR仪（美国PE Cetus公司）；9600型DNA合成仪（美国Beckman公司）；Oligo 1000凝胶显示分析系统（英国Gene公司）；GDS-7500。

　　2.白血病细胞分离及消化：取白血病患儿骨髓或外周血(要求幼稚细胞大于70 %)2～4 ml，经PBS稀释后，分别加到含2～3 ml的淋巴细胞分离液中，1 500 r/min，离心20 min；取淋巴细胞层置于另一管中，加入PBS混匀，15 00 r/min，离心5～10 min，洗 2～3次备用；将沉淀移入Eppendorf管中，加600 μl淋巴细胞裂解液，37℃过夜或55～60℃，温育3 h。

　　3.白血病细胞DNA抽提：在白血病细胞悬液中加600 μl酚/氯仿(1∶1)，混匀至乳白色，5 min；10 000r/min， 4℃，离心10 min；取上清(注意勿吸取蛋白层)；重复上述步骤1次；加600 μl氯仿/异戊醇 (24∶1)，混匀，5 min；10 000 r/min 4℃，离心10 min；弃上清，加600 μl冷异丙醇，1/10体积的3 mol/L醋酸钠，混匀；10 000 r/min 4℃，离心10 min；加600 μl 70%冷乙醇，洗DNA后10 000 r/min 4℃，离心10 min；空气干燥，加200 μl TE溶解DNA；至完全溶解后用紫外分光光度计测DNA含量：DNA含量=A₂₆₀×核酸稀释倍数×50/1 000 (μg/μl) (1A值的吸光度相当于双链DNA浓度为50 μg/ml)。将DNA用TE调浓度至0.1 μg/μl，4℃下保存。

　　4.D-PCR检测p16基因缺失：（1）引物设计：目的基因引物序列为：

　　p16 外显子1： 上游5′-TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGC-3′，

　　下游 3′-GCGCTACCTGATTCCAATTC-5′；

　　外显子2： 上游5′-TCTGACCATTCTGTTCTCTC-3′，

　　下游3′-CTCAGCTTTGGAAGCTCTCA-5′；

　　外显子3： 上游5′-GGATGTTCCACACATCTTTG-3′，

　　下游3′-ATGAAAACTACGAAAGCGGG-5′。

　　以上均由美国Sybersyn公司合成。

　　内对照基因：JRT：上游5′- GCAGGAGACCCTGATGGAGGAC-3′，

　　下游3′-GGGTGCTGAGACGAGGGACTC-5′。

　　exon1、exon2可直接用p15基因作内对照。以上引物由北京市肿瘤所吕有勇教授提供。(2)步骤：根据待测样品的数目，制备D-PCR的反应混合物。配制100 μl反应体系按每管20 μl分装，各加入样品DNA(0.1 μg/μl)1 μl后混匀。PCR循环仪进行DNA扩增。反应条件为：94℃、5 min；94℃、 45s→56℃、45s→72℃、45s， 30个循环；72℃、10 min。

　　取PCR产物5 μl，凝胶电泳60 V 电压下30 min，凝胶成像系统下照相后在光密度扫描仪上进行定量。若某标本目的基因与竞争性片段的比值远小于对照基因与其竞争性片段的比值，则判定为目的基因缺失。

　　5.单链构象多态性聚合酶链反应(SSCP-PCR)检测p16基因突变：（1）按标准PCR反应扩增20 μl。（2）根据所分离DNA片段的大小配制聚丙烯酰胺的浓度。（3）电泳：1 μl扩增产物加入5 μl测序终止液，90 ℃变性5 min。0.25×TBE电泳，恒流7 mA，4～10 ℃，6～8 min。（4）银染：10 %乙醇固定10 min；1.0 %硝酸还原10 min；0.012 mol/L的硝酸银250 ml (内含250 μl甲醛)染色30 min；0.28 mol/L冷Na₂CO₃ 250 ml(内含125 μl甲醛)显色；10 %冰醋酸终止反应；50% 乙醇脱水，封存于塑料袋中。以上各步骤间用蒸馏水冲洗3次，观察结果。

　　结果

　　一、儿童急性白血病p16基因缺失及其特点

　　我们就51例儿童白血病的临床资料、免疫表型和p16基因的缺失情况进行了研究(表1、2)。

　　由表1、2可知，51例儿童AL中，ALL占84%（43/51）。其中，高危型ALL（HR-ALL）占56%、标危型ALL（SR-ALL）占44%；高白细胞ALL占37% (16/43)。ANLL占16%（8/51）。肝肿大者占74%，脾肿大者占59%。儿童急性白血病p16基因exon1、2、3的缺失率分别为32%（12/38）、44%（17/39）和29%（12/42）。其中T-ALL的缺失率为最高，exon1缺失6例中有4例、exon2缺失6例中有4例，而exon3则6例中有3例缺失。ANLL未发现一例患儿发生p16基因缺失。图1显示 4、5号病例exon3（189 bp）发生缺失，图2显示2号病例exon2(335bp)发生缺失。

　　二、儿童ALL p16基因突变分析

　　儿童白血病p16基因SSCP-PCR检测结果表明：与双链DNA对照相比，本组白血病患儿单链DNA均呈对称双带型，即无一例发生p16基因突变。

表1　51例儿童急性白血病临床资料（例数）

　　^*系指白细胞≥25×10⁹/L

表2　51例儿童急性白血病p16基因缺失情况（例数）

　　注：exon1：281bp、n=38；exon2：335bp、n=39；exon3：189bp、n=42

4、5号病例exon3（189 bp）缺失

图1　儿童白血病p16基因 (Exon3) 缺失

号病例发生exon2 (335 bp)缺失

图2　儿童白血病 p16基因 (Exon2)缺失

　　讨论

　　1994年Kamb等在染色体9p21克隆出一个新的抑癌基因——多重肿瘤抑制基因-1，由于其编码是一个16 000的蛋白，故称为p16基因。p16基因编码的蛋白通过直接抑制细胞周期素依赖激酶-4(CDK4)与cyclin D结合来阻断细胞周期，从而抑制细胞增殖。在正常情况下,p16基因和cyclin D交互抑制CDK4的活性,维持细胞正常的增殖和分化。当p16基因缺失或突变时,cyclin D与CDK4结合,催化Rb基因磷酸化,而磷酸化后的Rb基因丧失了对细胞增殖和分化的负性调控作用,由此引发细胞的恶性增殖。

　　Ogawa等^［1］用Southern印迹法、SSCP-PCR法及直接测序法对410例血液系统恶性肿瘤p16基因缺失、点突变进行了研究。结果显示,410例中有59例p16基因缺失,其中45例(76 %)为纯合子缺失。在髓系白血病中p16基因纯合子缺失极为罕见;而淋巴系白血病则多为高频率缺失。有意义的是慢粒急变者仅在急淋变时有p16纯合子缺失^［2］。研究表明,血液系统恶性肿瘤中p16基因异常主要为外显子1和2的纯合子缺失。本结果也表明，儿童白血病p16基因的变异以缺失为主。文献报道小儿AL的p16基因总缺失率仅为10%^［3］。本研究中p16 的exon1、exon2、exon3缺失率分别为32%、44%和29%。而用SSCP-PCR法检测则无一例发生突变。

　　p16基因纯合子缺失频率较高。按表面标志可将其分为高频率的T细胞型、低频率的B细胞型和介于二者间的普通(common)型：(1)T-ALL：1994年Hebert等^［4］报道 T-ALL的p16基因纯合子缺失率竟高达83%(20/24)。而Ogawa等^［1］报道其缺失率仅为15%(3/20)。多数文献报道，T-ALL的p16基因缺失频率约为25 %～70 %^［5-8］。说明p16基因与T-ALL的发生发展密切相关。(2)common-ALL:该型ALL的p16基因缺失率为15 %～30 %^［5-8］。p16基因的纯合子缺失似乎与WBC数高、DNA指数为近二倍体及肿瘤负荷大有关^［3］。提示p16基因缺失与ALL的发生有关，对白血病的临床诊断和预后判断均有重要参考价值。(3)B-ALL:Quesnel等^［7］检测12例B-ALL,p16基因无一例缺失。本组T-ALL的p16基因缺失率最高：exon1和 exon2均为4/6、exon3为3/6，基本与国外报道(25 %～80 %)相同。而Common-ALL的缺失率分别为5/30(17 %)、10/30(33 %)和5/30(17 %)。这可能与common型预后强于T-ALL有关。B-ALL 3例中无一例发生缺失，可能与病例数太少有关。今后应进一步加强对p16基因变异与儿童白血病临床相关性的研究。

　　Ogawa等^［1］报道ANLL 134例中有2例p16基因异常，与Fizzotli等^［9］的报道一致。本组8例ANLL中无一例发生p16基因变异。提示p16基因似乎与ANLL的发生关系不密切。p16基因的这种偏向性值得进一步研究。综合分析表明，儿童急性白血病p16基因缺失有以下特点：（1）缺失率高，以T-ALL的p16基因缺失率为最高；（2）以淋巴系统倾向的缺失为主。p16基因在白血病发生中的作用，尚需深入研究。

　　参考文献

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　　3，Takeuchi S,Bartram CR,Seriu T,et al. Analysis of a family of cycle-dependent kinase inhibitors：p15/MTS2/INK4B, p16/MTS1/INK4A, and p18 genes in acute lymphoblastic leukemia of childhood. Blood,1995,86:755-760.

　　4，Hebert J,Cayuela JM,Berkeley J,et al. Candidate tumor-suppressor genes MTS1(p16^INK4A) and MTS2(p15^INK4B ) display frequent homozygous deletions in primary cells from T-but not from B-cell lineage acute lymphoblastic leukemias. Blood,1994,84:4038-4044.

　　5，Otsuki T,Clark HM,Jaffe ES,et al. Involvment of CDKN2(MTS1/p16^INK4A) and MTS2/p15^INK4B in human leukemias and lymphomas. Cancer Res,1995,55:1436-1440.

　　6，Ohnishi H,Kawamura M,Sheng XM,et al. Homozygous deletions of p16/MTS1 gene are frequent but mutations are infrequent in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995,86:1269-1275.

　　7，Quesnel B,Preudhomme C,Philippe N,et al. p16 gene homozygous deletions in acute lymphoblastic leukemia. Blood,1995,85:657-663.

　　8，Rasool O,Heyman M,Brandter LB,et al. p16^INK4A and p15^INK4B gene inactivation in acute lymphocytic leukemia. Blood,1995,85:3431-3436.

　　9，Fizzotli M,Cimino G,Pisegna S,et al. Detection of homozygous deletions of the CDK4 inhibitor(p16) gene in acute lymphoblastic leukemia and association with adverse prognostic features. Blood,1995,85:2685-2690.

（收稿日期：1999-05-04）