脂餐后血浆乳糜微粒及其残粒相对含量与冠心病的关系

中华心血管病杂志 1999年第2期第27卷 冠心病研究

作者：张原力　游凯　孙杰　薛红　范中杰　陈保生　方圻

单位：100730 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院心内科（张原力、 游凯、范中杰 、方圻）；中国医学科学院基础所生化国家重点实验室（薛红、陈保生）；北京安贞医院心脏儿科（孙杰）

　　关键词： 冠状动脉疾病；乳糜微粒；高脂血症

　　【摘要】　目的　探讨脂肪餐负荷后，血浆乳糜微粒(CM)及其残粒的含量与冠心病病变程度的关系。方法　40例经冠状动脉造影证实的冠心病患者（CHD组）及32例健康人（对照组）禁食12～14小时后接受标准脂肪餐负荷试验，分别采集餐前及餐后6小时新鲜血浆进行密度梯度超速离心，分离d＜1.006 g/ml及d=1.006～1.019 g/ml脂蛋白组份，以3.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及激光密度扫描法测定上述两种脂蛋白组份中apo B₄₈占总apo B的百分含量，以此间接反映乳糜微粒及其残粒的相对含量。结果　餐后6小时， CHD组血浆甘油三酯浓度及增量显著大于对照组。CHD组d＜1.006 g/ml apo B₄₈的百分含量及增量均显著大于对照组（P值分别＜0.01～0.001），提示餐后6小时CM含量在CHD患者显著增多。餐后6小时，多支病变组d=1.006～1.019 g/ml apo B₄₈的百分含量及增量均显著大于单支病变组（P值分别＜0.05～0.001），提示多支病变者餐后CM残粒的含量显著增加。结论　结果提示，餐后CM及其残粒含量增加与冠心病的发病及病变程度密切相关，可能是冠心病的危险因素之一，有必要进行大系列临床及流行病学研究证实。

　　Chylomicrons and chylomicron remnants in coronary heart disease: A case-control study　　ZHANG Yuanli, YOU Kai, SUN Jie, et al. Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730

　　【Abstract】　Objective　Epidemiologic studies have largely overlooked the atherogenic role of triglyceride-rich lipoproteins circulation in the postprandial state.We conducted a case-control study to test the effect of chylomicrons and chylomicron remnants on coronary heart disease.Methods　In 40 cases with coronary heart disease verified by coronary angiography and 32 healthy control subjects, density gradient ultracentrifugation was undergone using 3.5 ml fresh plasma before and 6 hours after a standard test meal to separate the d ＜1.006 g/ml fraction, which contained very low density lipoproteins (VLDL), chylomicrons and large chylomicron remnants, and d=1.006-1.019 g/ml fraction containing VLDL remnants (intermediate density lipoprotein, IDL) and smaller chylomicron remnants. The apo B₄₈/apo B ratio in d＜1.006 g/ml fraction, a relative content of chylomicron and that in d=1.006-1.019, a relative content of smaller chylomicron remnants were measured using the methods of 3.5% polyacrylamide gel electrophoresis and densitometry.Results　The apo B₄₈/apo B ratio in d＜1.006 g/ml fraction 6 hours after the meal was significantly higher in CHD cases than in controls, indicating the amount of chylomicrons in postprandial plasma was larger in CHD cases. The apo B₄₈/apo B ratio in d=1.006-1.019 g/ml fraction 6 hours after the meal was significantly higher in cases with multivessel lesions than in cases with single vessel lesion, indicating the amount of chylomicron remnants was related with the degree of coronary artery disease.Conclusions　The above results suggest that the relative concentration of chylomicrons and chylomicron remnants is a risk fator for coronary heart disease alongside other conventional factors.

　　【Key words】　coronary heart disease　　chylomicrons　　hyperlipidemia

　　血浆富含甘油三酯脂蛋白（TGRL）水平增高与动脉粥样硬化及冠心病（CHD）的关系，是目前心血管疾病基础与临床研究的焦点。一系列研究发现，餐后甘油三酯（TG）水平增高与冠心病发病密切相关，高度提示是重要危险因素之一^［1］。餐后脂血症可大致分为两个时期：早期以肠道来源的乳糜微粒（CM）增加为主，晚期则主要是肝脏合成及释放极低密度脂蛋白（VLDL）增多所致^［2］。以往认为，餐后血浆中CM存留半衰期短，清除快，且脂蛋白颗粒直径大，因此致动脉粥样硬化性弱。但缺乏严格合理的病例对照研究，且受方法学影响。本研究通过分析空腹及餐后6小时TGRL apo B₄₈的相对含量以探讨CM及CM残粒与CHD病变程度的相关性。

　　资料与方法

　　一、研究对象

　　1.CHD组：共40例于1995年10月 ～1996年6月在北京协和医院心内科住院经冠状动脉造影证实的患者。男36例，女4例；年龄42～70岁（平均年龄57.1岁）。单支病变19例，多支病变21例。近6个月内无心肌梗塞发作史。

　　2.对照组：共32例，男25例，女7例；年龄40～65岁（平均55.5岁）。为同期来院做健康体检者。无冠心病的症状、体征，无糖尿病及高血压史。次极量心电图运动负荷试验（采用改良Bruce方案）。超声心动图检查无心脏结构及功能异常。以上研究对象均符合以下条件：(1)无糖尿病及肾脏病史，甲状腺功能正常；(2)无消化吸收不良；(3)空腹血清总胆固醇（TC）水平＜7.80 mmol/L，总TG水平＜3.33 mmol/L；(4)近3个月内未用调脂药及静脉注射肝素，近1周未用β受体阻滞剂及利尿剂。

　　二、口服脂肪餐负荷试验

　　所有研究对象均进行脂肪餐负荷试验，方案参照国外标准^［3］，并结合中国人饮食习惯改良制定：热量为600 kcal/m²体表面积， 脂肪、蛋白质及碳水化合物提供的能量分别占60%、14%及26%，餐中饱和脂主要为黄油。多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比为0.1。受试对象禁食12～14小时后，于试验日清晨15分钟内进食脂肪餐，分别采集餐前(0小时)及餐后6小时2个点的血标本，以EDTA抗凝（1 mg/ml），于30分钟内分离血浆，即刻进行脂蛋白分离，部分血浆置-70℃冻存，于1个月内测定血脂。在8小时脂餐试验期间，只允许适量饮白开水，慢散步。

　　三、血脂测定

　　血浆TG及TC浓度采用酶法，高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）采用磷钨酸镁沉淀法及酶法。LDL-C=TC-(TG/5+HDL-C), 式中各项指标的单位均为mg/dl，TG＜400 mg/dl时此公式适用。以上测定均使用同一台日本产AU-5031 Olympus全自动生化分析仪在本实验室最佳条件下进行，质控合格。以上血脂指标的批间变异系数分别为：TC≤2.6%，TG≤2.2%，HDL-C≤5.3%。

　　四、CM及其残粒相对含量的测定

　　1.测定原理：每个TGRL颗粒均含有一个apo B分子（apo B₁₀₀或apo B₄₈），apo B₄₈仅存在于乳糜微粒及其残粒中。两种apo B的分子量已明确，分别为550 KD与225 KD。通过十二烷基硫酸钠（SDS）变性后的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并用标准分子量蛋白标识，可将apo B₄₈与apo B₁₀₀分离开。然后经固定染色，激光密度计扫描，便可半定量不同脂蛋白亚组份中apo B₄₈占总apo B的百分比。d＜1.006 g/ml apo B₄₈的百分比标志着CM的相对含量；d=1.006～1.019 g/ml apo B₄₈的百分比标志着CM残粒的相对含量。

　　2.脂蛋白的分离：分别取餐前及餐后6小时的新鲜血浆各3.5 ml，用NaBr将血浆的水合密度调整为1.250 g/ml，将其吸入离心管的底部，然后自下而上逐层铺盖d=1.063 g/ml，d=1.019 g/ml及d=1.000 g/ml 的密度梯度液各2.8 ml，采用XL-90超速离心机，Ti90角转头（Beckman Instrument,PaloAlto,CA,USA）在4℃，7 000 r/min条件下超速离心2小时。离心完毕后，以取样器自下而上吸出脂蛋白超离液，按每管0.5 ml的量分管收集，用Abbey折射仪测定每管的折光系数，再从表中查出相应的水合密度。d＜1.006 g/ml组份含CM及极低密度脂蛋白（VLDL）；d=1.016～1.019 g/ml 含CM残粒及中间密度脂蛋白（IDL）。

　　3.CM及其残粒的半定量分析：取含240 ul蛋白的超离液进行Warnic丙酮：无水乙醇法脱脂，在4℃以4 000 r/min速度离心30分钟沉淀载脂蛋白，再重复脱脂2次，用无水乙醚洗涤1次，氮气吹干备用。将干燥的载脂蛋白沉淀溶解于240 ul，浓度为50 mmol/L的磷酸钠缓冲液(2％SDS，5％二巯基乙醇，10％甘油及0.02％溴酚兰，pH 7.2），96℃加热变性4分钟，取40 ul容积上样电泳。采用SDS-连续系统垂直板状凝胶（3.5％聚丙烯酰胺凝胶）进行电泳。电泳缓冲液为0.1％SDS，0.1M，pH 7.2磷酸钠缓冲液，先以20 mA电流电泳15～20分钟使样品进胶，然后增大电流至50 mA，待指示染料迁移至胶板下缘1～1.5 cm处停止电泳。电泳结束后，将凝胶浸入0.25％考马斯亮兰R-250乙酸甲醇水中固定染色过夜，再于酸甲醇脱色液中脱色数次（先50％甲醇：10％乙酸；后10％甲醇：10％乙酸），直到蛋白条带清晰，背景透明为止。经上述处理好的凝胶采用连接计算机系统的激光密度计（Pharmacia LKB Ultroscan XL Laser Densitomitor,瑞士产）在600 nm光谱进行扫描，由计算机自动积分计算apo B₄₈在apo B中的百分含量，本方法经重复性检验显示：批内及批间测量变异系数≤7％。

　　五、统计学处理

　　计量资料用非配对t检验及协方差分析，计数资料用卡方检验。计量资料表示方法：均数±标准差（±s），以P＜0.05为有统计学显著差异的界限。

　　结果

　　一、CHD组与对照组血脂指标对比

　　CHD组与对照组相比，除体质指数（BMI）显著增加外，年龄、性别、吸烟史（规律吸烟2个月以上者）等一般指标差异无显著性，空腹时各项血脂指标的水平在两组间差异均有显著性。餐后6小时血浆TG浓度及其增量在病例组均显著大于对照组（表1）。分别以空腹血浆TG、HDL-C浓度及BMI作为协同变量，对CHD组与对照组间餐后6小时的血浆TG浓度进行协方差对比分析显示，消除了上述因素的混杂干扰后，差异仍显著（P＜0.01）。

表1　CHD组及对照组一般资料及血脂水平对比(±s)

注：BMI：体质指数＝体重/身高²;0TG、6TG、Δ6TG分别为0小时、6小时血清TG浓度及其差值

　　二、脂餐前、后乳糜微粒及其残粒相对含量的对比分析

　　1.CHD组与对照组脂餐前、后CM及CM残粒含量的对比：空腹状态下， CHD组与对照组CM及CM残粒的含量差异均无显著性（P＞0.05）；餐后6小时，CHD组CM的含量显著大于对照组（P＜0.01），CM残粒的含量在两组间差异无显著性（P＞0.05）。餐后6小时，CM及CM残粒的增量在CHD组均显著大于对照组（P＜0.001，P＜0.01）（表2）。

表2　CHD组与对照组脂餐前后apo B₄₈/apo B (%)对比(±s)

　　注: * 校正空腹血清TG水平后差异仍有显著性；0h、6h、6h-0h 分别为空腹、餐后6小时及两者差值，表3同此表

　　2.多支病变组与单支病变组脂餐前后CM及CM残粒含量的对比：多支组与单支组相比，餐前CM及CM残粒的含量差异均无显著性（P＞0.05）；餐后6小时，CM残粒的含量在多支组显著大于单支组（P＜0.05），而CM的含量在两组间则差异无显著性（P＞0.05），餐后6小时CM残粒的增量在多支组显著大于单支组，差异具有高度显著性（P＜0.001）（表3）。

表3　多支组与单支组脂餐前、后apo B₄₈/apo B (%)对比(±s)

　　3.CHD组（40例）与对照组（32例）共72例做了血浆脂蛋白分离及apo B₄₈的半定量分析，结果显示：餐后6小时d＜1.006 g/ml apo B₄₈的百分含量与血清TG浓度间无显著相关（r=0.2275，P＞0.05）；d=1.006～1.019 g/ml apo B₄₈的百分含量与d＜1.006 g/ml apo B₄₈的百分含量间有显著的相关性（r=0.4980，P＜0.001）。

　　讨论

　　血浆TGRL由肝脏来源的VLDL及肠道来源的CM组成，两种脂蛋白的根本区别在于所含apo B不同，前者为apo B₁₀₀，后者由同一基因通过不同的遗传调节产生，因分子量约为apo B₁₀₀的48％，故命名为apo B₄₈。VLDL与CM进入血液循环后竞争性地与血管内皮细胞表面的脂蛋白脂肪酶（LPL）发生作用，水解其中TG成分，同时通过胆固醇酯转移蛋白（CETP）的介导与HDL及LDL相互交换脂质成分，使VLDL与CM转变为相应的脂蛋白残粒，VLDL的残粒——IDL还可进一步代谢为终末脂蛋白LDL，而经肝细胞表面的LDL受体清除。而CM残粒不再继续转化，而是直接经肝细胞表面的残粒受体（apo E受体或LDL受体相关蛋白）清除。在以上整个代谢过程中，apo B₄₈恒定地以1∶1比例存在于CM及CM残粒中，因此， apo B₄₈的含量可反映CM及CM残粒的数量。Schneeman等^［2］研究表明，在餐后脂血症的峰值期，大约仅有一半TG聚集在CM及其残粒颗粒中，另一半则存在于VLDLs中，后者的峰水平略置后于前者。通常以进食后6小时作为划分晚期餐后脂血症的界限，此时，主要以肝脏来源的VLDL水平增高为主，本研究选择该时间点有利于评估CHD患者CM及CM残粒代谢延迟与否。定量餐后CM及CM残粒灵敏而特异的方法是直接采用免疫方法测定血浆及不同脂蛋白亚组份中apo B₄₈的含量，但由于目前尚无只与apo B₄₈而不与apo B₁₀₀起免疫亲合反应的特异性单克隆抗体，故无法进行。研究参考Simons等^［4］及Cabezas等^［5］学者的方法，先以SDS-PAGE分离apo B₁₀₀及apo B₄₈，然后以考马斯亮兰R-250着色，用激光密度计半定量d＜1.006与d=1.006～1.009 g/ml脂蛋白组份中apo B₄₈占apo B总体的百分含量，以间接表示CM及CM残粒的相对含量。该方法已被近期流行病学研究采纳，通过研究发现，餐后6小时CHD患者d＜1.006 apo B₄₈的百分含量及其增量均显著大于健康对照者，表明餐后6小时CM含量在CHD患者显著增多；多支冠状动脉病变组餐后6小时d=1.006～1.019 g/ml apo B₄₈ 的百分含量及增量均显著大于单支冠状动脉病变组，表明多支病变者餐后CM残粒含量显著增加。提示餐后CM及CM残粒含量的增多与CHD发生及发展有关。本研究还发现餐后6小时d＜1.006 apo B₄₈ 的百分含量与血清TG 浓度无显著相关，提示肝脏来源的TGRL在餐后高脂血症中起同样重要的作用。Simons等^［4］发现，餐后4小时Sf＞60 apo B₄₈/apo B₁₀₀的比值与CHD发病危险性呈显著正相关。通过多元Logistic回归分析排除了年龄及空腹血脂指标的混杂干扰后，仍然是CHD的独立预测指标。 ARIC研究发现颈动脉内中膜增厚者餐后8小时 d＜1.006 apo B₄₈/apo B₁₀₀的比值显著增大^［6］，在一项有重复冠状动脉造影资料的年轻心肌梗塞存活者的脂餐试验中，Karpe等^［7］未发现apo B及LDL-C与冠脉粥样硬化病变的进展有关， 然而却发现餐后CM残粒的含量与病变的进展独立相关，与本研究结果一致。

　　由于本研究样本量较少，且为横断面资料，故所得结论有待大系列研究证实。对照组未行冠状动脉造影是一缺陷，但据我院资料，有临床症状及危险因素的高危人群冠状动脉造影阴性者，相当大比例冠状动脉内超声检查有粥样硬化斑块；而无临床症状及危险因素的低危人群心电图运动负荷试验的假阴性率极低（约5%），故仍不失为临床研究中选择健康对照的可行方法。餐后TGRL致动脉粥样硬化机制尚不清楚，可能涉及凝血与纤溶活性、HDL-C水平及LDL表型的改变，还可能有直接作用机制参与。

　　参考文献

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