β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度与冠心病的相关性研究

中华心血管病杂志 1999年第4期第27卷 临床研究

作者：马会利　陈纪林

单位：100037　北京，中国医学科学院　中国协和医科大学　阜外心血管病医院冠心病研究室

　　关键词： 冠状动脉疾病；β HaeⅢ多态性；纤维蛋白原

　　【摘要】　目的　研究β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ多态性(H1H1、H1H2、H2H2)和血浆纤维蛋白原浓度与冠心病（CHD）之间的关系。方法　对66例CHD患者和53例健康对照者分别进行β HaeⅢ多态性分析和血浆纤维蛋白原浓度测定。抽提DNA采用酚、氯仿方法，血浆纤维蛋白原浓度测定采用Follin酚法。结果　（1）CHD患者携带H1H2，H2H2基因型频率较正常对照组明显增高（P＜0.01）；（2）β HaeⅢ多态性与血浆纤维蛋白原浓度间存在显著正相关（r=0.65,P＜0.001），以β HaeⅢ酶切位点缺失的H1H2、H2H2基因型血浆纤维蛋白原浓度明显增高（P＜0.01）。结论　CHD患者携带H1H2，H2H2基因型频率高，血浆纤维蛋白原浓度高，是CHD患者动脉血栓形成的主要原因之一。

The association between β HaeⅢ polymorphisms located in

　　fibrinogen levels and coronary heart disease

MA Huili　CHEN Jilin

　　Research Laboratory of CHD, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, Beijing 100037

　　【Abstract】　Objective　To study the association between plasma fibrinogen levels and the β HaeⅢ polymorphisms located in the promoter rigion of the β fibrinogen gene in patients with coronary heart disease (CHD).Methods　β HaeⅢ polymorphisms and plasma fibrinogen levels were simultaneously measured in 66 patients with CHD and 53 control subjects. DNA was extracted using the phenol/chloroform method. Plasma fibrinogen concentration was assayed with Follin phenol method.Results　(1) The frequencies of the genotype H1H2, H2H2 were higher in patients with CHD than in control subjects (P＜0.01). (2) β HaeⅢ polymorphisms are significantly associated with plasma fibrinogen levels (r=0.65, P＜0.001). The genotypes (H1H2,H2H2) which lost cutting site for β HaeⅢ enzyme showed that plasma fibrinogen levels were higher in this group (P＜0.01).Conclusion　The frequencies of the genotype H1H2, H2H2 were higher in patients with CHD as compared with control subjects and plasma fibrinogen levels in CHD patients were significantly increased. It may be one of the major factors of thrombosis in patients with coronary heart disease.

　　【Key words】　coronary heart disease　　β HaeⅢ polymorphism　　fibrinogen

　　冠心病（CHD）患者体内存在凝血和纤溶失衡，主要表现凝血功能过强及纤溶系统活性降低，导致冠状动脉内血栓形成。大量实验研究及流行病学资料均显示血浆纤维蛋白原浓度升高是CHD发病的一个独立危险因素,而且与纤维蛋白原基因改变有一定关系^［1-3］。本研究旨在探讨国人β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度与CHD的关系，对CHD血栓形成的分子生物学机制作初步探讨。

　　资料与方法

　　1.对象选择：自1996年3月至1996年12月间在本院住院的CHD患者随机入选66例，年龄30～69岁，平均年龄（49.7±9.7）岁,男55例，女11例。均符合WHO冠心病诊断标准,并经选择性冠状动脉造影确诊,其中心绞痛23例,陈旧性心肌梗塞43例，有CHD阳性家族史37例(56.1%)。患者直系亲属中凡具备下列条件之一者为家族史阳性：（1）心肌梗塞；（2）脑血栓；（3）未提供明确诊断，但有偏瘫证据者。正常对照组53例，年龄33～64岁，平均年龄（49.1±7.6）岁，男31例,女22例,有阳性家族史11例（20.8%）,均为本院健康职工及家属。

　　2.β HaeⅢ多态性分析及血浆纤维蛋白原浓度测定方法:早晨空腹,肘静脉采血,分别用3.8%枸橼酸钠及2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）抗凝(V/V,9∶1),枸橼酸钠血浆标本用于纤维蛋白原浓度测定(Follin酚法,凝血酶由天津血液病研究所提供)。EDTA抗凝血分离白细胞,用酚、氯仿抽提方法提取人基因组DNA，采用多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,主要参照Thomas等^［2］方法。一对上下游引物序列分别为：5′-GGAATGCAATCTCTGCTACCT-3′,5′-TGTCGT-TGACACCTTGGGAC-3′。PCR循环参数94℃预变性90秒,继之进入30轮循环——93℃变性30秒,61℃退火30秒,72℃延伸90秒,扩增目的基因片段长度约1.3kb(图1)。取30μlPCR产物,加HaeⅢ限制性内切酶10～20单位,37℃水浴消化2～4小时,最后放入2%琼脂糖凝胶电泳，置超紫外灯下显影，获得三种基因型：（1）H1H1，指在-453碱基（bp）处无HaeⅢ酶切位点缺失的纯合基因型，将1.3千碱基（kb）长的目的基因片段切成三条带：575bp、383bp、343bp。（2）H2H2指在-453bp处存在HaeⅢ酶切位点缺失，故用HaeⅢ内切酶切不开，呈现两条带型：958bp、343bp。（3）H1H2指两个等位基因其中一个在-453bp处无酶切位点缺失，另一个有酶切位点缺失，为杂合基因型，酶切后呈现四条带型：958bp、575bp、383bp、343bp（图2）。

图1　5组目的基因片段

图2　酶切后三种基因型

　　3.统计学处理：所有数据输入计算机，用SPSS软件包处理。结果以均数±标准差(±s)表示。相关性分析采用多元线性回归分析方法，计算回归系数（r）值。计量资料采用方差分析，计数资料采用卡方（χ²）检验，P＜0.05为差异有显著性。

　　结果

　　1.CHD与正常对照组β HaeⅢ多态性分布频率（%）：两组比较差异有显著性（P＜0.01），见表1。

表1　CHD组与对照组β HaeⅢ多态性频率(%)

　　注：^**与对照组比较，P＜0.01　　2.β HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度的关系：相关分析结果示:β HaeⅢ多态性与血浆纤维蛋白原浓度间存在极显著正相关（r=0.65,P＜0.001）。CHD患者多表现为H1H2，H2H2基因型，故血浆纤维蛋白原浓度平均值明显高于正常对照组(5.5±0.9）比(4.5±0.8)g/L,P＜0.01,见表2。

表2　β HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度与CHD

　　的关系（±s）

　　注：^*与对照组比较，P＜0.05；^**与H1H1比较，P＜0.001　　3.家族史与β HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度的关系：家族史阳性者多表现H1H2，H2H2基因型，血浆纤维蛋白原浓度较高（P＜0.01）,见表3。

表3　家族史与β HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度

　　的关系（±s）

　　注：^*与家族史（-）组比较，P＜0.05；^**与H1H1比较，P＜0.01　　4.H1、H2等位基因频率（%）分布情况：CHD组及家族史阳性者H2等位基因频率明显高于正常对照组和家族史阴性者（P＜0.01）,见表4。

表4　H1、H2等位基因频率(%)

　　注：^**与对照组比较，P＜0.01；^▲与家族史（-）组比较，P＜0.01

　　讨论

　　纤维蛋白原是体内重要凝血因子，多项研究^{［1，3，4］}证明血浆纤维蛋白原浓度增高会导致体内血液粘稠度增加，血小板聚集性增强，动脉血栓发生率增加，并促进动脉粥样斑块的进展。目前已经发现CHD患者血浆纤维蛋白原浓度增高与纤维蛋白原基因改变有关^［1-5］。人纤维蛋白原基因结构已经全部被克隆，它定位于4号染色体长臂，长度大约50kb，分为α、β、γ三种基因，分别编码Aα、Bβ、γ三对纤维蛋白原多肽链，其中β链在纤维蛋白原合成过程中起着重要的限速作用^［1，6］。Behague等^［1］研究发现β纤维蛋白原基因有10种多态现象，用多变量分析方法证明仅有两种多态性—βHaeⅢ和β-854与血浆纤维蛋白原浓度存在独立相关性。我们对66例CHD患者及53例健康者对照分别进行了β纤维蛋白原基因启动子区（-453bp）HaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度的相关性研究，结果显示：CHD患者H2等位基因频率及H1H2，H2H2基因型频率均明显高于正常对照组（P＜0.01），见表1、4，且证明血浆纤维蛋白原浓度变化与βHaeⅢ多态性之间存在极显著的正相关（r=0.65,P＜0.001）。以酶切位点缺失的H2H2纯合子血浆纤维蛋白原浓度最高（6.4±0.5）g/L，非酶切位点缺失的H1H1纯合子血浆纤维蛋白原浓度最低（5.0±0.4）g/L，H1H2杂合子血浆纤维蛋白原浓度界于两者之间（6.2±0.7）g/L，说明凡是携带H2等位基因者，无论是H2H2纯合子，还是H1H2杂合子其血浆纤维蛋白原浓度均高于H1H1纯合子，本结果与国外报道一致^［1-4］。文献报道血浆纤维蛋白原浓度超过5g/L，血栓发生的危险性相应增加4倍^［5］，说明CHD患者血浆纤维蛋白原浓度高，是动脉血栓发生率增加的主要因素，而基因改变在其中起着主要的决定性作用。本组统计CHD患者有阳性家族史占56.1%，明显高于正常对照组20.8%，而且发现具有阳性家族史者H2等位基因频率高，多表现H1H2、H2H2基因型，血浆纤维蛋白原浓度也相对较高，见表3、4，进一步说明CHD患者冠状动脉内血栓形成确有遗传性因素参与，而且H2等位基因可能是CHD发病的一个危险因子。

　　综上所述，β HaeⅢ多态性(H1H1、H1H2、H2H2)通过影响血浆纤维蛋白原浓度而在CHD发病中起着很重要作用。认为H2等位基因是造成血浆纤维蛋白原浓度升高的主要原因之一，与CHD患者冠状动脉内血栓形成有着极为密切的关系。

　　参考文献

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　　4　Humphries SE, Ye S, Talmud P, et al. European atherosclerosis research study: genotype at the fibrinogen locus (G-455-A β-gene) is associated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in Europe. Evidence for gender-genotype environment interaction. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995,15: 96-104.

　　5　Koster T, Rosendaal FR, Reitsma PH, et al. Factor VII and fibrinogen levels as risk factors for venous thrombosis. A case—control study of plasma levels and DNA polymorphisms——the Leiden Thrombophilia Study (LETS).Thromb Haemost, 1994,71:719-722.

　　6　Montgomery HE,Clarkson P, Nwose OM, et al. The acute risk in plasma fibrinogen concentration with exercise is influenced by the G-453-A polymorphism of the beta-fibrinogen gene. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1996,16:386-391.

收稿：1998-07-08　修回：1999-02-01