哮喘病人B细胞体外产生IgE过程中幼稚性T细胞的影响作用

中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 临床免疫学

作者：徐伟　黄瑾　安东善　李淑芳 刘素舫

单位：徐伟　黄瑾　安东善　李淑芳　白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科，长春 130041；刘素舫　白求恩医科大学第二临床学院检验科，长春 130041

关键词：哮喘；幼稚性T细胞；IgE；B细胞

　　摘　要　目的：探讨支气管哮喘发病机制中T细胞的调节作用。方法：分离出病人辅助性T细胞中的幼稚性(Naive)T细胞亚群即CD4⁺CD45RA⁺T细胞亚群，并将其与各自的B淋巴细胞共同培养。同时设定非特异性刺激原PWM(美洲商陆)刺激组及非刺激组，测定培养上清液中IgE含量。结果：非刺激组病人IgE含量明显高于健康对照(P＜0.01)，刺激组病人与健康对照IgE含量无显著差别(P＞0.05)。结论：支气管哮喘病人幼稚性T细胞在IgE产生中起到了正向促进作用。

　　中国图书分类号　R441.5　R441.8

The effects of naive T lymphocytes on IgE prodution by B lymphocytes in patients with bronchial asthma

XU Wei, HUANG Jin, AN Dong-Shan et al. Department of Respiratory Medicine, The Second College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130041

　　Abstract　Objective:To study the role of naive T lymphocytes in the development of asthma.Method: The authors isolated naive T lymphocytes (CD4⁺CD45RA⁺ T cell) from peripheral blood of patients with bronchial asthma and health donors and culture them with autodogous B cells. The level of IgE in the supernatant from cultured cells conditioned with PWM was determined.Results:Secreted IgE in the supernatant from patients was significantly higher than that from normal donors in non-stimulated group. There are not difference in IgE production between patients and normal donors in PWM-stimulated group.Conclusion:It suggests that naive T lymphocytes from patients with bronchial asthma have a positive effect on secreting IgE.

　　Key words　Bronchial asthma Naive T lymphocyte IgE B lymphocyte

　　自60年代哮喘发病机制研究中石坂的IgE学说问世，特异性IgE产生与哮喘的关系逐渐被人们承认，但是IgE产生的机理尚不十分清楚。近年的研究进一步证明，CD4⁺T细胞对免疫球蛋白的产生并不是都具有正向辅助作用，其中幼稚性T细胞即按白细胞表面分化抗原CD45将CD4⁺T细胞亚群进行分类的CD4⁺CD45RA⁺T细胞起一定的抑制作用被视为CD4⁺T细胞中的负向平衡成分^［1］。因此，在探讨哮喘发病机制过程中，既应该探讨IgE产生的促进因素，也应该研究与其相互平衡的抑制因素。本文从哮喘病人CD4⁺T细胞中分离出CD4⁺CD45RA⁺T细胞亚群，观察其对B细胞产生IgE的影响作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　检测对象　36例哮喘急性发作期病人为我院呼吸内科就诊者，未经激素治疗，诊断符合1997年青岛全国哮喘会议修订的哮喘诊断标准^［2］，其中男10例，女26例，年龄为17～70岁，平均年龄为39.8岁。25例健康对照为我市中心血站献血员，女6例，男19例，年龄为19～48岁，平均年龄为31.5岁。

　　1.2　外周血单个核细胞(PBMC)的分离　取静脉血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）分离出PBMC，备用。

　　1.3　T、B细胞的分离　采用尼龙毛柱法，见文献［3］。实验过程如下：PBMC悬液离心后调成1 ml细胞悬液，加入直径3 mm，长100 mm的尼龙毛柱中，37℃CO₂培养箱中放置1 h后，用Hank′s液轻轻冲洗尼龙毛柱，自然流出部分为T细胞，经挤压后流出部分为B细胞。

　　1.4　CD4⁺CD45RA⁺T细胞亚群的分离　将分离好的T细胞调成1 ml细胞悬液置于24孔培养板中，加入抗CD8单抗（北京医科大学免疫室），37℃反应40 min，再加入兔血清（我室制备），37℃反应1 h，洗涤细胞，调成1 ml细胞悬液(CD4⁺T细胞)分别加入抗CD45RO⁺单抗（美国PharMingen公司）和兔血清，各反应40 min和1 h，洗涤细胞，调成细胞悬液至1×10⁶ ml^-1，备用。

　　1.5　细胞培养　将具有活性的CD4⁺CD45RA⁺T细胞与B细胞(5×10⁵/孔)在IMD培养基中培养9 d，刺激组加入PWM(美国Sigma公司)10 μg/ml，9 d后收取上清液，贮存于-30℃冰箱待测。

　　1.6　IgE检测　用抗人IgE单抗试剂盒（北京协和医科大学免疫室），方法参照文献［4］，用DG3022酶标仪490 nm测定A值（旧制为OD值）。

　　2　结果

　　2.1　哮喘病人CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的影响　见表1，病人B细胞与自体CD4⁺CD45RA⁺T细胞共同培养后，IgE产生量经统计学处理明显高于对照。

　　2.2　PWM刺激后CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的影响　为了观察CD4⁺CD45RA⁺T细胞活化后对B细胞产生IgE的影响，本实验用PWM作为刺激原,体外对CD4⁺CD45RA⁺T细胞进行刺激，然后观察对自体B细胞产生IgE的影响。结果显示：病人B细胞与自体CD4⁺CD45RA⁺T细胞共同培养，IgE产生量与健康对照比较经统计学处理无明显差别（表1）。

　　2.3　PWM刺激前后CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的作用　如表1所示，哮喘病人自然状态CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的作用明显高于活化后CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的影响；而正常人CD4⁺CD45RA⁺T细胞体外活化前后对自体B细胞产生IgE的影响无明显差别。

表1　哮喘病人及正常人CD4⁺CD45RA⁺T细胞活化前后对自体B细胞产生IgE影响作用

　　Tab.1　Effects of activated and non-activated CD4⁺CD45RA⁺T cells on IgE production by B cells in asthma patients and health donors

	Level of IgE in the supernatant(±s, a value old unit was OD value)		t	p
	Primitive CD4+CD45RA+T cells	PWM-stimulated CD4+CD45RA+T cells
Patient group	0.444±0.154(n=20)	0.313±0.128(n=24)	1.9081)	＜0.05
Normal group	0.293±0.211(n=25)	0.329±0.228(n=24)	0.5742)	＞0.05
t	2.6333)	0.3074)
p	＜0.01	＞0.05

　　note:1)compared with primitive and PWM-stimulated CD4⁺CD45RA⁺T cells in patient group; 2)compared with primitive and PWM-stimulated CD4⁺CD45RA⁺T cells in normal group; 3)compared with patient group and normal group of PWM-stimulated CD4⁺CD45RA⁺T cells; 4)compared with patient group and normal group of PWM-stimulated CD4⁺CD45RA⁺T cells3　讨论

　　伴随对支气管哮喘发病机制研究的不断深入，已认识到哮喘是以病变局部过敏性炎症改变为特点的变态反应性疾病。T淋巴细胞中的调节性T细胞（CD4⁺T细胞）对B淋巴细胞产生IgE等免疫球蛋白有明确的调解控制作用。CD4⁺CD45RA⁺和CD4⁺CD45RO⁺两组亚群是CD4⁺T细胞发挥调节作用的一对平衡因素，它们在B细胞产生免疫球蛋白过程中，分别从促进和抑制促进两方面进行控制使特异性免疫球蛋白的产生恰到好处。上述两组细胞中的任何一种表现功能异常都将影响机体正常的免疫过程，甚至促成变态反应的发生。在本实验中观察到哮喘病人离体的自然状态CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE有明显的辅助促进作用，其IgE产生水平明显高于健康对照，健康人幼稚性T淋巴细胞对B细胞产生IgE不应有明确的辅助作用，故哮喘病人的上述改变应视为异常。许多变态反应性疾病病人外周血中CD4⁺CD45RA⁺T细胞所占比例高于正常人^［5］。另外，CD4⁺CD45RA⁺T细胞可以通过刺激其自身TCR(T细胞抗原受体)，使其活化并具有辅助IgE产生的能力。因此，我们认为哮喘病人的幼稚性T细胞处于失衡状态，且较健康人的幼稚性T细胞明显活化，并参与了IgE的产生，可能在哮喘的发病机制中起一定作用，具体作用方式有待于进一步的研究。为进一步探讨体外活化后CD4⁺CD45RA⁺T细胞与B细胞产生IgE的相互作用关系，本文还分别在各组中加入了非特异性刺激原即PWM。结果显示，哮喘患者体外刺激后的CD4⁺CD45RA⁺T细胞对B细胞产生IgE的影响作用和健康对照无明显差别。这表明，体外实验时接受PWM刺激，病人幼稚性T细胞对B细胞产生IgE的抑制作用恢复到与健康人相同水平。本研究还观察了哮喘病人和健康人的幼稚性T细胞体外活化前后对自体B细胞产生IgE的作用。结果发现，哮喘病人体外活化的幼稚性T细胞对B细胞产生IgE的抑制作用达到与正常人相同水平，而正常人体外活化前后的幼稚性T细胞对B细胞产生IgE的作用无明显差别。由此可见，PWM刺激后哮喘病人幼稚性T细胞的异常功能状态得以调整，而原本处于正常状态的健康人幼稚性T细胞接受PWM刺激后仍处于正常状态。

　　因此，本文认为哮喘病人幼稚性T细胞的功能异常参与了哮喘发病，并且哮喘病人的幼稚性T细胞功能改变可能与自身活化状态有关。

　　本课题受国家自然科学基金资助（批准号：39400047)

　　作者简介：徐　伟，男，38岁，硕士，主治医师，主要研究呼吸系统疾病；

　　黄　瑾，男，39岁，副教授，硕士生导师，主要研究哮喘发病机制

　　4　参考文献

　　1　Rothstein D M,Sohen S, Daley J F et al. CD4CD45RA and CD4 CD45RA T cell subsets in man maintain distinct function and CD45RA expression persists on a subpopulation of CD45RA cells after activation with CoA.Cell Immunol ,1990；129:449

　　2　中华医学会呼吸病学会全国哮喘会议.支气管哮喘的定义、诊断、严重分度分级及疗效判断标准(修正方案).中华结核和呼吸杂志,1997；20(5)：261

　　3　杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990:11

　　4　Brinkmann V, Kristofic C. TCR Stimulated naive human CD4CD45RO cells develop into effector cells that secrete IL-13,IL-5 and IFN-γ but not IL-4,and help efficient IgE production by B cells.J Immunol, 1995；154:3078

　　5　Schauer U ,Jung T , Heymans J et al. Imbalance of CD4CD45R and CD4CD29 T helper cell subsets in patient with atopic disease. Clin Exp Immunol， 1991； 83:25

〔收稿1997-11-05　修回1998-06-01〕