支气管哮喘发病中β₂AR mRNA水平变化的初步探讨△

中国病理生理杂志 1999年第6期第15卷 论著

作者：高海鹏　薛全福　林友华　王立荣　赵琪平　陈育智

单位：高海鹏　林友华　北京中日友好医院呼吸科(北京　100029)；薛全福　王立荣　赵琪平　中国医学科学院病理生理研究室；陈育智　北京首都儿科研究所

关键词：哮喘；受体；肾上腺素能；β；RNA；信使

　　摘　要　目的：初步探讨β₂AR mRNA在支气管哮喘发病中的变化。方法：用RT-PCR及原位杂交方法测定哮喘时人外周淋巴细胞及大鼠肺组织β₂AR mRNA水平。结果：缓解期哮喘患者β₂AR mRNA水平与正常人无显著差异。发作期哮喘大鼠肺组织β₂AR mRNA水平显著降低，且肺内不同组织细胞β₂AR mRNA水平的下降程度并不一致。结论：提示哮喘时β₂AR mRNA的变化可能是β₂AR变化的分子基础，这对哮喘治疗具有重要的实际意义。

Study on the changes of β₂AR mRNA in bronchial asthma

　　GAO Hai-Peng, XUE Quan-Fu, LIN You-Hua, WANG Li-Rong,

　　ZHAO Qi-Ping, CHEN Yu-Zhi

　　Abstract AIM:To preliminaryly inquire into the changes of β₂AR mRNA levels in bronchial asthma.METHODS： To measure the β₂AR mRNA levels in asthmatic peripheral lymphocytes and the lungs of challenged rats by using RT-PCR and in situ hybridization.RESULTS：(1) Expression of β₂AR mRNA in peripheral lymphocytes of asthmatics at remission stage was no significant differences compared with that in normal volunteers; (2) Expression of β₂AR mRNA in the lungs of challenged rats decreased markedly, but β₂AR mRNA levels among various tissues inside lung decreased to different extent after allergen challenge.CONCLUSION： Changes of β₂AR mRNA might underlie the changes of β₂AR in the lungs of asthmatics and challenged rats, and it also furnished theoretical basis for the useage of β₂AR agonists clinically.

　　MeSH　Asthma; Receptors, adrenergic, beta; RNA, messenger

　　支气管哮喘(以下简称哮喘)的发病机制很复杂，迄今尚未完全阐明。1968年，Szentivanyi^［1］提出哮喘发病的β肾上腺素能受体(β-adrenoceptor, βAR)阻滞学说。此后，人们对βAR在哮喘发病中的作用进行了广泛研究，但结果相互矛盾。我们曾报道缓解期哮喘患者βAR密度明显高于正常人，并推测这种变化可能与哮喘患者所处状态有关，只是哮喘病程中伴随出现的一种病理变化^［2］。后来我们对不同期哮喘患者βAR及血浆cAMP\,cGMP水平变化进行的观察证实了我们的设想(另文发表)。为了进一步探讨哮喘时βΑR变化的分子机制，我们分别检测哮喘患者外周淋巴细胞及大鼠肺组织的β₂AR mRNA。

　　材料与方法

　　一、材料：

　　1.实验对象：人体实验部分：健康对照组19例，男9例，女10例，年龄21～57岁。无心肺及其它器官器质性疾病，无过敏性疾病史及家族史。1月内无上呼吸道感染；缓解期哮喘患者15例，男7例，女8例，年龄20～61岁。受试者采血前24 h停用支气管扩张剂，48 h停用β₂AR激动剂，1月内未用任何皮质激素类药。动物实验部分：200 g左右雄性Wistar大鼠。按苗会等的方法(另文发表)复制哮喘大鼠模型，先在大鼠皮下注射卵蛋白及氢氧化铝混合液，同时腹腔注射灭活百日咳菌苗，2周后经气道滴入1.7%的卵蛋白激发，处死取其肺组织用于β₂AR mRNA测定。

　　2.主要设备与试剂：XHF-1高速分散器(上海兴华电子仪器厂)，Slee恒冷切片机(England),Beckman RC-SC型高速冷冻离心机(USA)，3K30型低温高速离心机(Sigma)，PCR循环仪(中国科学院遗传所)，Beckman LS-9800液闪计数仪(USA)。AMV-RT(Promega), Taq DNA聚合酶(中国科学院遗传所)，［α-³²］?P-dC TP(Amersham), Dig DNA Labeling and Detection Kit (Boehringer mannheim)。

　　二、方法：

　　1.人外周淋巴细胞β₂AR mRNA测定：常规方法分离外周单个核细胞，并按chomczynski等^［2］的方法提取总RNA并进行电泳鉴定。根据Kobilka等^［4］报道人β₂AR基因序列设计合成一对寡核苷酸引物。下游引物序列为5′-CATAGGCTTGGTTCGTGAA-3′，上游引物序列为5′-ATTGAGACCCTGTGCGTGA-3′，经计算机检索证明有很好的特异性，用于RT-PCR反应，并通过其产物的放射性测定来反映β₂AR mRNA的相对含量。2.大鼠肺组织匀浆β₂AR mRNA测定：根据Buckland等^［5］报道的大鼠β₂AR基因序列设计合成一对寡核苷酸引物，下游引物序列为5′-CATAGGCCTGGTTCGTGAA-3′,上游引物序列为5′-ATCGAG ACCCTGTGCGTGA-3′，亦经计算机检索证实有很高的特异性，用于RT-PCR反应，其余与人体实验相似。3.大鼠肺组织β₂AR mRNA原位检测：按照RNA检测要求制备大鼠肺组织冰冻切片，置-70℃存放。通过含β₂AR cDRNA质粒细菌培养，感受态细胞制备与转化，质粒限制性内切酶酶切分析及大量制备、纯化与cDNA目的片段回收制备β₂AR cDRNA探针，并用酶反应法进行标记及检测，用于原位杂交。最后通过计算机图像处理系统测定肺组织杂交信号的辉度值，反应β₂AR mRNA的水平。

　　三、统计处理：

　　数据以()表示，差异显著性用t检验检测。

　　结果

　　(一)正常人与缓解期哮喘患者外周淋巴细胞β₂AR mRNA测定结果见表1。

表1　正常人与缓解期哮喘患者外周淋巴细胞

　　β₂AR mRNA水平比较

　　Tab 1　Comparison of β₂AR mRNA levels in peripheral lymphocytes

　　between normal subjects and asthmatics in remission stage ()

^*P＞0.05，vs NS group; NS： normal subjects; AM: asthmatics in remission stage

　　(二)正常与哮喘大鼠肺组织匀浆β₂AR mRNA测定结果见表2。

表2　正常与哮喘大鼠肺组织匀浆β₂AR

　　mRNA水平测定结果比较

　　Tab 2　Comparison of β₂AR mRNA levels in the

　　lungs between normal and challenged rats ()

^*P＜0.001， vs NG ； NG:normal group； CG: challenged group

　　(三)正常与哮喘大鼠肺内不同组织β₂AR mRNA分布见表3。(表中数值均为肺组织杂交信号的辉度值)。

表3　正常与哮喘大鼠肺内不同组织β₂AR mRNA分布

　　Tab 3　Comparison of change of β₂AR mRNA in various tissues inside the lungs between normal and challened rats ()

^*P＜0.05,**P＜0.01, vs NG； NG：normal group;　CG：challenged group;　ASM：airway smooth muscle;　AE: airway epithelium;　BV: blood vessels;　AW:alveolar wall

　　讨论

　　近年来关于哮喘时β₂AR变化基因调控机制的研究倍受重视。由于取材困难，故通过测定外周淋巴细胞β₂AR mRNA来反应气道相应变化。我们测定了正常人及缓解期哮喘患者外周淋巴细胞β₂AR mRNA水平。结果显示两组之间无显著差别，与Bai等^［6］报道的结果一致。对此，我们认为有以下几种可能性：(1)缓解期哮喘患者具有正常的β₂AR mRNA表达水平；(2)缓解期哮喘患者β₂AR mRNA水平虽然与正常人未有显著性差异，但可见有升高趋势，这也可能是我们以前测定的缓解期哮喘患者外周淋巴细胞β₂AR密度增高的分子机制之一；(3)外周淋巴细胞β₂AR仅是肺内β₂AR变化的模型，两者β₂AR基因表达的调控由于受到不同因素的影响而并不完全一致。因而淋巴细胞β₂AR mRNA水平的变化能否完全反映肺内β₂AR mRNA的变化仍有待进一步验证。

　　为直接观察肺β₂AR mRNA水平的变化对哮喘发病的影响，我们直接测定哮喘大鼠及正常大鼠肺组织匀浆β₂AR mRNA水平。结果显示，发作期哮喘大鼠肺组织β₂AR mRNA水平显著低于正常大鼠(P＜0.001)。这与多数作者实验结果显示的抗原刺激后肺β₂AR 密度降低相吻合。提示β₂AR mRNA水平的变化，可能是β₂AR变化的分子基础。这一结果对哮喘治疗具有重要启示。哮喘发作期β₂AR mRNA水平下降必然导致β₂AR数量减少。如果此时单独长期应用β₂AR激动剂，则必然使β₂AR mRNA进一步下降，β₂AR 数量也将进一步减少。这样反过来又将导致对β₂AR激动剂的过量使用及依赖，从而形成恶性循环。糖皮质激素可以通过增加β₂AR mRNA水平而使β₂AR表达增加^［7］，因而可以迅速恢复哮喘发作导致的β₂AR mRNA下降及重新恢复β₂AR激动剂的反应性。

　　尽管哮喘时β₂AR mRNA水平可能出现变化，然而，肺内β₂AR的变化在不同的细胞类型并不完全一致。β₂AR mRNA与β₂AR分布存在明显相关。我们对哮喘大鼠肺组织β₂AR mRNA进行了原位检测。结果显示，正常大鼠肺组织内以血管，气道上皮β₂AR mRNA分布最多，大气道平滑肌及肺泡上皮β₂AR mRNA水平相对较低，这与Hamid等^［8］的结果相似。然而，原位检测显示，哮喘大鼠肺内不同组织细胞β₂AR mRNA的下降程度并不一致。气道平滑肌，气道上皮，血管及肺泡壁β₂AR mRNA水平的相对辉度值较正常对照组虽然都有显著升高，即β₂AR mRNA都有显著降低(辉度越高，β₂AR mRNA水平越低，反之亦然)，但肺血管及气道上皮β₂AR mRNA降低程度较之气道平滑肌更为明显。哮喘大鼠肺内各组织细胞间β₂AR mRNA变化的差异具有重要的实际意义。气道平滑肌具有相对较高的β₂AR mRNA，在受到抗原刺激后其β₂AR mRNA的降低又不如血管及其它组织明显，这就有可能使气道平滑肌β₂AR表达维持在一个相对稳定的水平，这也从分子水平解释了气道平滑肌对β₂AR激动剂较之其它组织不易产生耐受，且出现耐受的时间更慢的原因。同时，我们似乎也可以作出如下合理的推测，即β₂AR激动剂在肺内尽管具有广泛的调节作用，然而，其主要功能仍然是通过松驰气道平滑肌达到扩张支气管的效应，因为β₂AR激动剂对其它组织细胞的作用可能会因迅速产生耐受而明显减弱。

　　△ 获中国病理生理学会缺氧和呼吸分会青年优秀论文一等奖

　　参考文献

　　1　Szentivanyi A. The beta-adrenergic theory of the atopic abnormality in bronchial asthma. J Allergy, 1968, 42:203.

　　2　高海鹏，林友华，薛全福，等.支气管哮喘患者外周淋巴细胞β肾上腺素能受体，通气功能及气道反应性之间的相关.中日友好医院学报，1993， 7：100.

　　3　Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium chioyanate-phenol-chloroform extraction. Ann Biochem, 1989, 162:156.

　　4　Kobilka BK. Delineation of the intron-less nature of the genes for the human and hamster β-adrenergic receptor and their putative promoter regions. J Biol Chem, 1987, 262:7321.

　　5　Buckland PR, Hill PM. Primary structure of the rat beta2-adrenergic receptor gene. Nucleic Acids Res, 1990, 18:682.

　　6　Bai TR, Zhou D, Aubert JD. Expression of β₂-adrenergic receptor mRNA in peripheral lung in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Am Respir Cell Mol Biol, 1993, 8:325.

　　7　Barnes PJ. Molecular biology of receptors. Q J Med, 1992, 301:339.

　　8　Hamid QA, Mak JCW, Sheppard MN. Localization of betaz adrenoceptor messenger RNA in human and rat lung using in situ hybridization: correlation with receptor autoradiography. Eur J Pharmacol, 1991, 206:133.