吸入糖皮质激素对哮喘内皮素和内皮素转化酶Mrna表达的影响

中华结核和呼吸感染 1998年第6期第0卷 论著

作者：何卫国　徐军　钟南山

单位：510180 广州，广州市第一人民医院呼吸科(何卫国)，广州呼吸疾病研究所(徐军、钟南山)

　　关键词： 内皮素1；内皮素转化酶；基因；治疗

　　【摘要】　目的　探讨内皮素1(ET-1)和内皮素转化酶(ECE)mRNA在哮喘气道粘膜的表达，以及吸入激素对其表达的影响。方法　应用逆转录-DNA聚合酶链反应，测定支气管粘膜组织ET-1和ECE mRNA的表达量；对支气管粘膜炎症程度进行评分。结果　哮喘非激素组(10例)和对照组(10名)ET-1 mRNA表达量分别为0.86±0.06，0.14±0.06(P＜0.05)；ECE mRNA表达量分别为0.31±0.04，0.30±0.05(P=0.238)；哮喘激素组(10例)ET-1 mRNA表达量为0.22±0.01，ECE mRNA表达量为0.16±0.01；哮喘非激素组粘膜炎症评分为6.0±1.9，且与ET-1 mRNA表达量呈正相关(r=0.78，P＜0.05)。结论　哮喘支气管粘膜ET-1 mRNA表达增高明显，而ECE mRNA无明显改变；吸入糖皮质激素显著抑制ET-1和ECE mRNA的表达，可能是抗炎治疗哮喘的机制之一。

Effect of inhaled-corticosteroids on the mRNA expressions of endothelin-1 and endothelin converting enzyme in bronchial asthma

He Weiguo, Xu Jun, Zhong Nanshan. 　Dept. of Respiratory Disease, First Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510120

　　【Abstract】　Objective　To investigate the expressions of endothelin-1(ET-1) and endothelin converting enzyme (ECE) mRNA in bronchial mucosal biopsis from asthmatics, and the effect of inhaled-corticosteroids on the expressions of ET-1 and ECE genes.Method　The expressions of ET-1 and ECEmRNA in bronchial mucosal tissue were evaluated by reverse transription DNA polymerase chain reaction (RT-PCR); With fibro bronchoscopy, the naked-eye inflammatory severity and inflammatory score of bronchial mucosas were recorded.Result　(1) The expression level of ET-1 mRNA was 0.86±0.06 in non-steroids-treated group and 0.14±0.06 in control non-asthmatic group. The expression of ECE mRNA in non-steroid group was 0.31±0.04, and 0.30±0.05 in control group, P=0.238. (2) The ET-1 and ECE mRNA expressions were 0.22±0.01 and 0.16±0.01 respectively in steroid treated group. (3) The naked-eye bronchial mucosal inflammatory score was 6.0±1.9 in non-steroids treated group, moreover, the expression of ET-1 mRNA was positively correlated with the score (r=0.78, P＜0.05).Conclusion　There was markedly higher ET-1 mRNA expression in the bronchial mucosa in asthmatics, but the ECE mRNA expression was unchanged significantly; Inhaled corticosteroids obviously inhibited both ET-1 mRNA and ECE mRNA expressions in bronchial mucosa, which may be one of the anti-inflammatory mechanism of inhaled-corticosteroid in management of bronchial asthma.

　　【Key words】　Endothelin-1　　Endothelin converting enzyme　　Gene　　Therapy

　　内皮素1(ET-1)是至今所发现最强烈的支气管平滑肌收缩剂，具有促进成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，以及促进粘膜下腺体分泌的作用^［1］。ET-1也参与哮喘的发生和发展。在ET-1的生物合成过程中，内皮素转化酶(ECE)是把无活性的大内皮素转化为ET-1的关键酶。我们的实验主要观察哮喘患者气道粘膜组织中ET-1和ECE mRNA的表达及观察吸入糖皮质激素对ET-1和ECE基因表达的影响，以说明哮喘发生发展的某些机制，并初步探讨临床应用吸入糖皮质激素治疗哮喘的部分机理。

　　对象与方法

　　1.对象：对照组10名，男5名，女5名，平均年龄30±2岁，均为实验前3～6个月未用口服或静脉或吸入糖皮质激素的非哮喘患者；哮喘非激素治疗组10例，男4例，女6例，平均年龄31±2岁，实验前3～6个月未用口服或静脉或吸入糖皮质激素，未用或不规则使用茶碱类和(或)β₂受体激动剂的哮喘患者；哮喘激素治疗组10例，男5例，女5例，平均年龄29±3岁，吸入二丙酸倍氯米松(beclomethasone)200～800μg/d至少2周以上。非激素治疗组和激素治疗组病情程度上差异无显著性(P＜0.05)。

　　2.方法：(1)气道炎症评分：粘膜活检：按Dahl等^［2］报道的评分标准(表1)，在纤维支气管镜肉眼直视下，对支气管粘膜炎症程度进行评分。选择右侧中间支气管，钳取粘膜活检组织4～6块。(2)总RNA提取：根据一步法^［3］提取总RNA。(3)逆转录合成cDNA：取无明显降解的总RNA约1～5μg，用逆转录试剂盒(Promega公司)合成cDNA。(4)PCR扩增cDNA：由上海细胞研究所合成如下引物：①肌动蛋白(β-actin)：上游：5′ATGTGGCACCACACCTT-CTACAATGAGCTGCG3′下游：5′CGTCATACTCCTG-CTTGCTGATCCACATCTGC3′用这对引物扩增出838 bp的β-actin片段。②ET-1引物：上游：5′AACCATGGATTATTTGTCCATG3′下游：5′AGTGTTGACCCAAA-TGATGTCC3′用这对引物扩增出230 bp的ET-1片段。③ECE引物：上游：5′AGCGTGAGCGAGGCAGA-GAG3′下游：5′GGGGTAGAAGATGGTGTTGA3′用这对引物扩增出567 bp的ECE片段。④PCR反应条件：ET-1：92℃1分钟→42℃ 2分钟→72℃ 3分钟，共35个循环，加强延伸：72℃10分钟。ECE：94℃ 1分钟→59℃ 1分钟→72℃ 1分钟，共35个循环，加强延伸：72℃7分钟。(5)PCR产物的鉴定和半定量：反应完成后，取15μl PCR反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，可见ET-1为230 bp条带、ECE为567 bp条带、β-actin为838 bp条带。立即在紫外凝胶图像分析仪上进行荧光亮度测定，计算ET-1/β-actin值和ECE/β-actin值。

表1　支气管炎症的评分标准

　　注：非激素组患者气道炎症评分=6.0±1.9　　3.统计学处理：组间显著性差异检验以t检验进行，P＜0.05为差异有显著性。

　　结果

　　一、三组患者ET-1和ECE mRNA的表达

　　对照组、非激素治疗组、激素治疗组均有ET-1和ECE mRNA的表达，三组共30例均呈阳性表达。

　　二、非激素组ET-1和ECE mRNA的表达

　　非激素治疗组ET-1 mRNA表达量(ET-1/β-actin值为0.86±0.06)明显高于对照组(0.14±0.06)，P＜0.05。ECE mRNA表达量(ECE/β-actin值为0.31±0.34)与对照组(0.30±0.05)比较差异无显著性P＞0.05(P=0.238，表2)。

表2　非激素治疗组ET-1和ECE mRNA的表达(±s)

　　三、吸入激素组ET-1和ECE mRNA的表达

　　激素吸入明显抑制ET-1 mRNA和ECE mRNA的表达量。激素治疗组和对照组ET-1/β-actin值分别为0.22±0.01，0.14±0.06(P＜0.05)，激素治疗组和对照组ECE/β-actin值分别为0.16±0.01，0.30±0.05(P＜0.05，表3)。

表3　激素治疗组ET-1和ECE mRNA的表达(±s)

　　四、吸入激素对气道炎症和患者肺功能的影响

　　激素治疗组患者气道粘膜纤支镜下观察，发现粘膜充血、水肿、易脆性等炎症表现明显减轻或消失，活检组织显微镜下少见或未见嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞浸润，粘膜上皮完整。吸入激素治疗组患者肺功能某些指标明显改善(表4)。

表4　吸入激素对哮喘患者肺功能的影响(实测值与预计值的百分比，±s)

　　注：两组间差异具有显著性P＜0.05　　五、气道炎症评分

　　非激素治疗组气道炎症评分为6.0±1.9，且ET-1 mRNA表达量与评分呈正相关(r=0.78，P＜0.05，附图)。

附图　非激素组ET-1 mRNA表达量与气道炎症评分的关系

　　讨论

　　内皮素(ET)首次由Yanagisawa等^［1］从猪主动脉内皮细胞培养的上清液中分离出来，它是由21个氨基酸残基构成的活性多肽。ET-1是当今所知道的最强烈的缩血管剂、最强烈的支气管收缩剂，而且还具有促进平滑肌细胞和成纤维细胞增殖作用，具有促进粘膜下腺体分泌效应。国内外学者证实，在哮喘动物模型和哮喘患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中，血浆^［4，5］或气道上皮细胞ET-1水平明显增高^［6］。最近文献报道^［7］，对无症状的哮喘患者行纤支镜粘膜活检，分离的上皮细胞与白细胞介素1(IL-1)、组胺(H)培养8～24小时，培养上清液中ET-1水平增高，上皮细胞中ET-1 mRNA表达上调。本组实验证实，哮喘患者气道粘膜组织ET-1 mRNA表达明显增高。非激素治疗组比对照组高6倍，我们还观察到，ET-1 mRNA上调水平与气道炎症程度呈正相关。说明ET-1参与了哮喘的慢性炎症过程，提示从ET-1的基因水平或蛋白质水平抑制ET-1的合成，可能是治疗哮喘的重要途径之一。

　　内皮素转化酶这一概念也是由Yanagisawa等^［8］提出的。ECE的生物活性是将大内皮素(BET)转化为ET。ECE是ET合成过程中的关键酶，在ET-1的生物合成中起重要作用。目前，ECE在哮喘患者气道上皮、肺泡灌洗液(BLA)或血浆中的分布、测定，基因表达等方面研究还尚少文献报道。本组实验证明，ECE在非激素治疗组和对照组的粘膜组织均有基因表达，但两者间差异无显著性(P＞0.05)。

　　在哮喘患者，气道上皮细胞中ET-1 mRNA表达增高^［6］。本组试验也证实哮喘患者气道粘膜组织中ET-1 mRNA增高约6倍。从我们的实验结果提示，哮喘患者气道粘膜ET-1增加可能是ET-1 mRNA表达上调的结果，而与ECE mRNA的表达量无明显关系。至于ECE mRNA无明显改变的原因，我们猜测，ET-1的增高可能反馈抑制ECE mRNA的表达，或某些细胞因子调控ECE的基因表达。最近文献报道^［9］，在大鼠的肾损害模型中，随着肾髓质ET-1活性增加，ET-1 mRNA表达明显增高，但内皮素3(ET-3)和ECE mRNA表达无改变，与我们的实验结果相似。

　　针对哮喘是一种慢性非特异性气道炎症，首选吸入糖皮质激素进行抗炎治疗已形成共识。有人对哮喘患者肺泡灌洗液ET-1水平观察，发现非糖皮质激素治疗组的ET-1水平增高，而以口服或吸入糖皮质激素治疗组BAL中ET-1无增高^［10］。Vittori等^［11］应用原位杂交法发现，在哮喘患者气道上皮细胞的原代培养液中，加入氢化可的松培养48小时后ET-1 mRNA表达有一定降低。我们的试验应用逆转录-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)证实，哮喘患者未应用吸入激素治疗时ET-1 mRNA表达明显增高，应用吸入激素至少2周后，ET-1 mRNA水平明显降低，但未降至正常对照组水平，同时进一步发现，吸入激素治疗组ECE mRNA水平明显低于对照组。我们认为：吸入糖皮质激素通过抑制ET-1和ECE二者的基因表达，抑制ET-1的合成，阻断或抑制哮喘的慢性炎症过程，这可能是吸入激素治疗哮喘的抗炎作用机制之一。

　　参考文献

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(收稿：1997-10-08　　修回：1998-01-19)