激素耐药型哮喘的研究进展

中华儿科杂志 1998年第8期第36卷 综　　述

作者：孔晓慧　江载芳　申昆玲

单位：100045 首都医科大学附属北京市儿童医院

　　糖皮质激素可有效地控制哮喘和其他炎症或免疫疾病。人们已认识到即使是轻型哮喘也存在气道炎症，所以吸入糖皮质激素已成为治疗持续性哮喘的一线用药。90%以上的哮喘在吸入或口服糖皮质激素后得到控制，但仍有约0.1%～1.0%的哮喘即使口服大量糖皮质激素也无反应^［1］。这类激素耐药型哮喘(corticosteroid-resistant asthma，CRA )尽管很少，仍为临床工作提出了严重的管理问题。阐明糖皮质激素作用的分子机制，有助于对CRA病理生理学方面的了解及其防治。

　　一、CRA的诊断、临床分型及意义

　　按照成人诊断标准，CRA是指每天口服泼尼松40 mg，14天后一秒用力呼气容积(FEV₁)改善小于15%；而激素敏感型哮喘是指服用泼尼松14天后，FEV₁改善超过30%^［2］。与激素敏感型哮喘相比，CRA患者口服大量激素后肺功能几乎无改善，最大呼气流量(PEF)值更低，症状持续时间更长，家族史更多见，这类患者无阿迪森症状，也无糖皮质激素耐药时多见的性激素异常，血浆皮质醇正常。

　　临床上CRA分为两型^［3］：Ⅰ型是相对激素耐药(激素依赖)。该型患者有过敏性炎症，正吸入或服用适量的糖皮质激素，已去除了诱发性过敏原，无鼻炎、胃返流或睡眠障碍性呼吸暂停，未服用大量β₂-受体激动剂，经至少6个月的严格管理试验治疗，只有服用大量激素才能控制症状。Ⅱ型患者是完全性激素耐药。此型患者具备Ⅰ型的全部特征，但对激素无反应。

　　有许多因素影响机体对激素的反应性，诱发哮喘持续状态。这些因素包括：错误的诊断、到达气道粘膜的激素量不足、持续暴露于过敏原、诱发哮喘药物的使用、大量使用β₂-受体激动剂气雾剂、未能按照严格的管理计划进行至少6个月的规律治疗。完全性激素耐药是正口服大量激素的患者停用或减少激素用量、考虑改用其他抗炎药物的指征；相对激素耐药也是正服用大量激素的患者改用其它抗炎药物以减少激素用量的指征。由于一些药物毒性大，要求临床医生确保正确的CRA诊断及临床分型，排除影响机体对激素反应性的众多因素。

　　对儿童激素耐药型哮喘目前尚无统一的诊断标准。因为各年龄组儿童哮喘的评价标准与成人不同，故不能沿用成人CRA的诊断标准。由于“哮喘防治的全球战略”的推广和药物剂型的改革等，多数儿童哮喘都能得到控制，耐药型哮喘很少，所以儿童激素耐药型哮喘的诊断应慎重。

　　二、CRA细胞免疫反应异常

　　CRA外周血单个核细胞功能异常。最早的研究表明：激素敏感型哮喘和CRA两组外周血单个核细胞、CD₄和CD₈T细胞、Ⅰ类抗原α亚单位(Ⅰα)阳性细胞数量无显著差异。近期研究表明：CRA组外周血单个核细胞对糖皮质激素的反应性较激素敏感型哮喘组明显减弱^［4，5］。体外研究证实：每日口服氢化泼尼松20 mg治疗哮喘一周后，激素敏感型哮喘组外周血单个核细胞补体表达较未治疗组显著减少，活化抗原补体受体1、3和Ⅱ类分子表达明显受抑；而CRA组上述分子表达无明显改变。用血凝素刺激外周血单个核细胞，10^-9～10^-8 mol/L甲基氢化泼尼松可抑制激素敏感型哮喘组的外周血单个核细胞克隆生长，而对CRA组的单个核细胞生长无影响。哮喘患者外周血单个核细胞的上清液具有中性粒细胞启动活性(neutrophii priming activity)，糖皮质激素可抑制激素敏感型哮喘组的中性粒细胞启动活性，而对CRA组无明显抑制作用。目前对于CRA组外周血单个核细胞功能异常属内在性(inherent)或诱导性(induced)的问题仍有争议。

　　CRA的外周血T细胞、单核细胞等存在同样的功能缺陷。哮喘激素耐药可能部分与T淋巴细胞抵抗激素抑制效应有关^［6］。辅助性T淋巴细胞(TH)按其产生的细胞因子类型分为两型^［7］：TH₁和TH₂。TH₁分泌γ-干扰素(IFN-γ）、白细胞介素(IL)-2、IL-12和淋巴毒素；TH₂分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等。TH₁增强细胞免疫反应，TH₂细胞支持体液免疫反应。TH₂促进IgE产生、嗜酸细胞的成熟、分化、趋化和活化等，参与气道炎症和哮喘发病机制。目前的实验研究表明：与激素敏感型哮喘组相反，CRA组外周血T淋巴细胞IL-2和HLA-DR表达增加^［8］。10^-7 mol/L氢化泼尼松可抑制激素敏感型哮喘组血凝素刺激T细胞增殖和分裂原诱导T细胞合成IFN-γ和IL-2，而在CRA组则无上述抑制效应。最近Leung等^［9］用原位杂交方法证实：糖皮质激素明显降低激素敏感型哮喘组支气管肺泡灌洗液细胞IL-4、IL-5 mRNA的表达，对CRA组支气管肺泡灌洗液细胞IL-4、IL-5mRNA表达无明显抑制，提示CRA组存在TH₂细胞缺陷。对哮喘纤维支气管活检肺组织进行原位杂交^［10］，结果表明：糖皮质激素治疗1周后激素敏感型哮喘组细胞表面IL-12 mRNA表达显著减少、IL-13mRNA表达显著降低，CRA组细胞表面IL-12、IL-13mRNA表达无上述改变，证实CRA组TH₂细胞功能异常。

　　三、CRA激素作用的分子机制

　　1.哮喘激素作用的分子机制：目前的研究已证实：糖皮质激素可减轻气道炎症，减少活化的嗜酸细胞、肥大细胞和T淋巴细胞数量。糖皮质激素与其受体结合后直接或间接调节靶基因转录，从而抑制炎症过程、控制哮喘发作^［11］。糖皮质激素在胞浆中与受体结合，后者暴露出各种分子伴娘(molecular chaperons)，使糖皮质激素-受体复合物易位于细胞核。在核内，受体二聚体与激素反应元件(即激素反应基因5′启动子上游顺式作用DNA序列)结合，调节特异性靶基因转录。

　　活化的糖皮质激素受体还通过激素依赖方式干扰其它转录因子如环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response elements binding protein，CREB)、活化蛋白-1(activator protein-1，Ap-1)和核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性，从而调节靶基因转录^［12］。其中与糖皮质激素免疫抑制关系最为密切的是Ap-1和NF-κB^{［13，14］}。肺细胞因子通过激活转录因子发挥其炎症效应，糖皮质激素受体经过亮氨酸拉链(leucine zipper)作用干扰转录因子的活性而抑制细胞因子的致炎作用^［15］。Ap-1是序列特异性的转录激活剂，由bZIP DNA结合蛋白jun和fos家族连接形成各种同源、异源二聚体，有特异性DNA结合位点，其核苷酸序列为TGACTCA。各种刺激如细胞因子、T细胞激动剂等均可激活Ap-1，糖皮质激素受体对胶原酶等金属蛋白酶和IL-2基因启动子的抑制就是通过干扰Ap-1活性而实现的。糖皮质激素受体抑制Ap-1反应基因依赖于配体结合，需要功能性DNA结合位点，无需活化的受体与激素反应元件结合，与Ap-1的结构无关。NF-κB与κB抑制剂(IκBs)形成无活性复合物存在于胞浆中。当细胞受到刺激时，特别是受到炎症介质如TNF-α、IL-1刺激时，κB抑制剂迅速发生磷酸化等反应，NF-κB异二聚体解体后易位于细胞核，激活靶基因转录。NF-κB可激活许多免疫调节基因，包括各种细胞因子、粘附分子、趋化因子RANTES(regulated upon activiation ，normal T cell-expressed and-secreted)等的调节基因，上述免疫基因受糖皮质激素负调控^［16］。活化的糖皮质激素受体与NF-κB P65(Rel)亚单位结合后抑制糖皮质激素反应基因的转录活性。此外，糖皮质激素还可通过促进κB抑制剂α亚单位合成而抑制NF-κB的活性。目前，由糖皮质激素受体介导的、对Ap-1和NF-κB活性干扰的机制是否相同仍存在争议，各种淋巴细胞和非淋巴细胞的NF-κB均对糖皮质激素敏感，尚未发现激素抵抗型NF-κB存在。

　　2.CRA激素作用的分子机制：各型哮喘糖皮质激素药代动力学无明显差异，哮喘激素耐药可能与激素受体-DNA结合异常有关。早期的研究表明：哮喘组与正常对照组之间激素最大血浓度及清除率均无明显差异。用³H-地塞米松对激素敏感型哮喘与CRA两组外周血单个核细胞进行竞争性研究发现，两组的地塞米松核受体数量、结合亲和力或活化的糖皮质激素-受体复合物核易位率差异不明显，表明哮喘激素耐药不能用激素受体核易位密度或结合亲和力差异来解释^［17］。体外糖皮质激素受体-HRE结合分析实验证明CRA组外周血单个核细胞的糖皮质激素受体-DNA结合功能受损^［18］，其原因可能与激素受体结构异常或其它转录活性分子干扰了激素受体转录有关。用PCR扩增技术和化学突变分析方法研究糖皮质激素受体cDNA片段证实^［17］：CRA组激素受体结构无异常改变，其蛋白序列与激素敏感型哮喘组无显著差异。故推测CRA组糖皮质激素受体-DNA结合异常可能由其它转录因子干扰所致。

　　哮喘激素耐药可能与Ap-1活性升高有关。Ap-1基础活性水平升高，可阻碍糖皮质激素受体和Ap-1与各自的同源性DNA结合，从而拮抗激素对靶基因转录的调节。近年来的研究表明：哮喘发作60分钟后，CRA组外周血单个核细胞的糖皮质激素受体与激素反应元件的结合率较激素敏感型哮喘组显著下降^［18］。用scatchard方法进一步分析证实激素受体与DNA结合的数量显著减少。CRA组Ⅰ型患者糖皮质激素受体-HRE结合下降是可逆的、获得性的，此改变仅限于T细胞；Ⅱ型患者激素受体-DNA结合异常是不可逆的、持久性的，可见于单个核细胞^［19］。激素敏感型哮喘组和正常对照组用血凝素刺激外周血单个核细胞、激活Ap-1后，糖皮质激素受体与激素反应元件的结合率下降，而CRA组血凝素的作用明显减弱；两组激素受体与其它转录因子如NF-κB、CREB等的作用无明显改变，提示CRA组糖皮质激素受体与Ap-1之间存在异常作用^{［17，20］}。经实验证实两组激素受体结构无显著差异后，CRA组糖皮质激素受体-DNA结合异常的可能机制与Ap-1自身缺陷或控制Ap-1活化的调节机制缺陷有关^［20］。序列分析实验表明，c-fos或c-jun序列无异常改变，提示糖皮质激素受体-DNA结合功能异常可能与c-fos或c-jun蛋白激活或失活有关。CRA组外周血单个核细胞的Ap-1基础活性水平增加、激活剂（如phorbol ester)刺激可明显促进c-fos mRNA和蛋白表达均支持上述观点。此外，已有实验表明Ap-1升高后通过干扰糖皮质激素受体转录而抑制了激素诱导猿白血病细胞MLA-E7T凋亡^［21］。嗜酸细胞凋亡可能是哮喘过程中炎症反应消退的机制之一，糖皮质激素可能通过抑制具有延退凋亡的细胞因子而调节嗜酸细胞凋亡^［22］。CRA组Ap-1活性增加是否可能通过糖皮质激素受体介导抑制糖皮质激素诱导嗜酸细胞凋亡、使哮喘气道炎症细胞持续存在、产生激素抵抗尚有待于证实。Ap-1基础活性增加的机制也有待于进一步证实。

　　另外，Ap-1异常也可能与选择性激素耐药有关。因为Ap-1可能在某些基因中起更重要的作用，并且不同靶基因对激素抵抗也存在差异性，这与转录因子的相对平衡有关。

　　四、CRA药物治疗的前景

　　因为免疫机制的参与，近年来已尝试用免疫抑制剂代替激素治疗CRA或严重哮喘。由于甲氨喋呤、环胞霉素A等药物疗效的个体差异较大，毒副反应明显，故尚未做为常规用药。目前人类不断探索着新的药物治疗方法，可绕过激素调节途径、却能达到与激素治疗同样效果即通过调节淋巴细胞功能调节细胞免疫。目前用细胞因子抑制剂、粘附分子阻滞剂、白细胞三烯拮抗剂治疗重症哮喘尚处于实验研究阶段^{［23～25］}，结果表明：IL-4单抗可阻断嗜酸细胞增加和气道高反应性；粘附分子VCAM/VLA-4阻滞剂可选择性抑制气道嗜酸细胞浸润；白细胞三烯拮抗剂能显著改善成人哮喘肺功能和临床症状，减少β₂-受体激动剂使用量。吸入诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂也是一种新的免疫疗法。此外，体外实验表明：NF-κB反义核苷酸有可能用于哮喘治疗。转录因子抑制剂可望成为21世纪治疗哮喘的新型抗炎药物^［26］。

　　只有少数哮喘对激素抵抗，其存在仍然为哮喘管理提出了新的挑战，加上哮喘需要长期甚至终生治疗，因而探讨CRA的机制，有助于发掘更安全、更具选择性的药物治疗哮喘，对于探讨发病早期治愈哮喘的可能性有着重大意义。另外，如何确定临床评价儿童CRA的客观标准也是值得研究的问题。

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