血管紧张素转移酶基因插入/缺失多态性与儿童哮喘的关系

中华儿科杂志 2000年第8期第38卷 论著

作者：秦建华　王鸾升

单位：秦建华（116011　大连医科大学附属第一医院儿科）；王鸾升（116011　大连医科大学附属第一医院儿科）

关键词：哮喘；肽基二肽酶A；多态现象(遗传学)；基因型

　　【摘要】　目的　探讨血管紧张素转移酶（ACE）基因插入/缺失多态性与儿童哮喘易感性的关系。方法　应用聚合酶链反应方法检测52例哮喘患儿，54例肺炎患儿及40例正常儿童的ACE基因型。用呼气峰速仪测定23例哮喘患儿的最大呼气流量作为评价肺功能的指标。 结果　三组儿童ACE基因型（II型、ID型、DD型）频率的分布差异有显著意义（P＜0.05）。哮喘组DD基因型频率为34.6%，与正常组（12.5%）和肺炎组（14.8%）比较，差异有显著意义（P均＜0.05）。哮喘组和正常组比较，DD型与ID型、DD型与II型的优势比OR分别为5.04和3.15（95%可信区间）。不同ACE基因型间比较哮喘患儿最大呼气流量占预计值的百分比，差异无显著意义（P＞0.05）。结论　ACE基因DD基因型与哮喘的易感性有关，可能是儿童哮喘的危险因素。

DD genotype of angiotensin-converting enzyme may be a risk factor for development of asthma in children

QIN Jianhua，WANG Luansheng（Department of Pediatrics, First Affliated Hospital, Dalian Medical University, Dalian 116011, China）

　　【Abstract】　Objective　The insertion/deletion polymorphism of angiotensin-converting enzyme (ACE) gene in intron 16 of a 287 bp nonsense domain was identified and shown to be closely associated with the levels of ACE in plasma and cells. ACE is heavily expressed in the lung and plays a key role in the metabolism of angiotensin II and inactivation of bradykinin peptides and substance P, which are potent bronchial constrictors and inflammatory mediators of asthma. The present study was conducted to assess the relationship between the insertion/deletion polymorphism of ACE gene and asthma in children. Methods　ACE genotypes were determined by polymerase chain reaction(PCR) in 52 asthmatic children, 54 children with pneumonia and 40 healthy controls. The peak expiratory flow rate (PEFR) was determined to evaluate the lung function of 23 asthmatic children. Results　The ACE genotype (II, ID and DD) distribution was significantly different among the three groups (P＜0.05). There was a high frequency of DD genotype of ACE gene in asthmatic children compared with the children with pneumonia and healthy controls (34.6% vs. 14.8%, 34.6% vs. 12.5%, P＜0.05). The odds ratio (OR) for developing asthma between patients with DD genotype and those with ID genotype and II genotype was 5.04 and 3.15, respecively. The asthmatic children were classified into two groups (DD and non-DD) according to their genotypes to compare their PEFR ratio; the result did not show any significant difference (P＞0.05).Conclusion　DD genotype of ACE gene may be related to susceptibility of children to asthma and may be a risk factor in development of asthma.

　　【Key words】　Asthma;　Peptidyl-dipeptidase A;　Polymorphism (genetics);　Genotype

　　支气管哮喘是儿童时期最常见的慢性呼吸道疾病。目前大量研究证实，哮喘是由遗传和环境因素共同作用的多基因遗传病，缓激肽和P物质等是哮喘发病中的重要炎性介质，这些物质可被血管紧张素转移酶（ACE）灭活或降解^［1］。ACE是肾素-血管紧张素系统的关键酶，广泛存在于肺、肾、心等组织的血管内皮和上皮细胞膜，主要在肺脏高度表达。90年代初，人类ACE基因结构得以阐明，并发现其第16内含子中存在一段287 bp的插入/缺失多态性，这一多态性与血清和细胞内ACE水平密切相关^［2,3］。本研究通过对ACE基因型的检测，旨在探讨ACE基因插入/缺失多态性与儿童哮喘的关系。

　　对象和方法

　　一、 对象

　　1. 哮喘组：共52例，其中男31例，女21例，平均年龄(6.9±2.7)岁。来源于1996年12月至1998年12月在我院就诊的患儿。全部符合全国儿科防治协作组制订的儿童哮喘诊断标准^［4］。

　　2. 肺炎组：共54例，其中男30例，女24例，平均年龄(7.2±2.4)岁，来源于上述同时期在我院就诊的患儿。既往无哮喘病史，无家族及个人过敏史。

　　3. 正常组：共40例，其中男23例，女17例，平均年龄(7.4±3.2)岁，均无哮喘病史，无家族及个人过敏史。

　　以上各组受检者均为无血缘关系的汉族人。

　　二、方法

　　1. 主要试剂：Taq聚合酶、dNTP、蛋白酶K均购自大连保生物工程有限公司。聚合酶链反应（polymerse chain reaction, PCR）所需引物参考Rigat等^［5］的设计，由大连保生物工程有限公司协助合成。引物序列为：

　　正链 5＇-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3＇

　　负链 5＇-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3＇

　　2. 基因组DNA的提取：参考文献［6］方法，取抗凝静脉血2 ml，3 000 r/min离心5 min，将白细胞层0.5 ml重悬于TEN裂解缓冲液中，加蛋白酶K至终浓度为0.1 mg/ml，37℃隔夜消化，次日晨用饱和酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，4℃保存。

　　3. PCR扩增ACE基因插入/缺失多态性：在冰浴中配制PCR反应混合液, 在50 μl反应体系中加入以上引物各10 pmol/L、4种dNTP混合液4 μl、模板DNA1 μg、TaqDNA聚合酶 0.25 μl（5 U/μl）,在PCR扩增仪上按以下条件进行循环反应：预变性94℃、5 min，变性94℃、1 min，58℃、1 min，72℃、2 min，共30个循环，72℃再延伸5 min。取扩增产物5 μl在1.2%琼脂糖凝胶中电泳20 min（恒压100 V，电泳液为1×TBE），紫外灯下观察结果并摄影。

　　4．肺功能测定：选择4岁以上哮喘患儿23例，测定其PEFR值并计算出PEFR占预计值的百分比。所有患儿均使用同一只峰流速仪，由专人测定。

　　三、统计方法

　　1. 计算三组人群中ACE基因各基因型频率和等位基因D、I的频率，然后经Hardy-Weinbery遗传平衡定律检验，确定各基因型频率已达到遗传平衡，具有群体代表性。

　　2. 组间基因型及等位基因型频率比较用 χ² 检验，组间非参数比较用秩和检验，基因型及等位基因的相对危险度以优势比 (odds ratio，OR)及95%可信区间（CI）表示，以上数据用 SPSS8.0 统计软件进行数据处理。

　　结果

　　一、ACE基因插入/缺失多态性分析

　　人类ACE基因位于染色体17q23，由26个外显子和25个内含子组成，以ACE基因第16内含子中是否存在一段287 bp的Alu重复序列为标志，构成了ACE基因三种基因型（II型、ID型、DD型）。如PCR扩增产物为190 bp，在190 bp处出现一条亮带，其基因型为DD型（缺失型），如扩增产物为490 bp，在490 bp处出现一条亮带，其基因型为II型（插入型）；如在190 bp 和490 bp处各出现一条荧光带，则基因型为ID型（杂合型）。

　　二、 三组儿童ACE基因各基因型频率和等位基因频率比较(表1)

　　1.哮喘组与肺炎组及正常组比较：三组儿童ACE基因型频率的分布差异有显著意义(χ²=9.931，P＜0.05)，其中哮喘组DD基因型频率高于正常组及肺炎组χ²为5.90和5.61，P均＜0.05）。三组儿童D、I等位基因频率的分布差异无显著意义（P＞0.05），但哮喘组D等位基因频率高于正常组（χ²=3.89，P＜0.05）。哮喘组和正常组比较DD型与ID型和DD型与II型的优势比OR分别为5.04和3.15（95%可信区间）。

表1　三组儿童ACE基因各基因型频率和

　　等位基因频率比较

　　基因型频率分布：总χ²=9.931, P＜0.05; 等位基因频率分布：总χ²=4.905, P＞0.05；哮喘组和正常组比较：OR(DD/ID)=5.04, 95%CI=1.46～17.43, P＜0.05；OR(DD/II)=3.15, 95%CI=1.02～9.69, P＜0.05　　2.肺炎组与正常组比较：两组比较ACE基因型频率分布，差异无显著意义（P＞0.05）;两组人群D、I等位基因频率比较，差异无显著意义（P＞0.05）。

　　三、 ACE基因多态性与PEFR的关系

　　23例哮喘患儿按不同的ACE基因型分成DD组（含DD型）和非DD组(含II型和ID型)，比较PEFR占预计值的百分比，前者为(69±21)%，后者为(62±23)%，差异无显著意义（P＞0.05）。

　　讨论

　　从1988年ACE基因被克隆，目前已发现多种ACE基因多态性标志。近年来研究最多的是位于第16内含子中一段长287 bp的插入/缺失多态性。大量研究表明，不同种族、地区人群中，该多态性的分布趋势不同，法国、德国、英国等人群中以ID型频率最高，II型最低，日本调查结果则显示，II型频率最高，而DD型频率最低。我国汉族正常人群以II型频率最多（55%），DD型最少（6%）^［7］，与日本人相近。我们的研究结果显示，本地区正常儿童以II型频率最高，DD型最少，且以I等位基因为主，说明ACE基因变异的种族、地区差异性，白种人中DD基因型及D等位基因频率较高，亚洲人群则以II型和I等位基因为主。

　　法国Benessiano等^［8］研究发现，哮喘患者ACE基因DD型频率最高，明显高于非哮喘人群，其次为ID型，且以D等位基因为主。我们对52例哮喘患儿的研究结果显示，以II基因型频率最高（46.2%），ID型最少（19.2%），其中DD基因型频率明显高于其他两组(P均小于0.05)，提示ACE基因插入/缺失多态性可能与哮喘有关；哮喘组和正常组比较其DD型与ID型和DD型和II型的优势比OR分别为5.04和3.15，表明正常人群中呈DD基因型发生哮喘的风险率高于ID型和II型，推测ACE基因DD基因型与哮喘的易感性有关，可能为儿童哮喘发病的危险因素。由于本研究病例数尚少，待进一步扩大样本来证实。

　　哮喘发作时支气管平滑肌痉挛，粘液分泌增多，肺功能表现为阻塞性通气障碍，PEFR下降，但PEFR容易受身高、年龄、性别等诸多因素的影响，尤其在儿童更为明显，因此，我们采用PEFR占预计值的百分比作为评价气道阻塞程度和哮喘病情严重程度的一个肺功能指标。结果显示，哮喘患儿ACE基因DD基因型与PEFR之间无相关性。

　　对大量群体研究表明，ACE基因多态性与血浆和细胞内的ACE水平密切相关，人群中每个个体的ACE水平都非常稳定，但不同基因型个体间血浆ACE水平却存在显著差异，ACE水平为DD型＞ID型＞II型，且DD型约为II型的2倍^［9,10］。研究发现，哮喘患者的肾素-血管紧张素系统被激活，其血浆肾素和血管紧张素Ⅱ（AⅡ）水平均增高^［11］，并在一组轻型哮喘患者中静脉试用AⅡ后出现支气管痉挛。动物试验证实，AⅡ能引起气道平滑肌及肺血管收缩，促进微血管渗漏和气道内炎症反应，能促进体外培养的人血管平滑肌细胞的生长，并可通过促进释放有收缩作用的炎性介质如内皮素等作用于平滑肌^［12,13］。由于ACE能将血管紧张素Ⅰ转换成具有高度血管收缩活性的AⅡ，我们推测呈DD基因型的个体由于循环中ACE水平较高，诱发肺内AⅡ产生增多，后者作用于气道平滑肌而参与哮喘的发病。

参考文献

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（收稿日期：1999-07-08）