幽门螺杆菌感染的动物模型

　　十余年来，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）与各种慢性胃病（慢性胃炎，消化性溃疡，胃癌等）之间的关系，基本上已取得了一致认识。可是仍然有许多问题有待解决。例如：Hp的致病及致癌机进、Hp感染的免疫预防治疗问题；抗Hp治疗方案及药物的改进、是否所有Hp感染者都需要用抗Hp治疗等。这些问题的解决除了靠临床资料的累积外，免不了需要在实验动物模型上作更深入的研究。然而，制备与Hp感染有关的慢性胃病的动物模型比较复杂、比较困难，因此尚未能普遍采用。问题在于Hp是一种人类胃部的寄生菌，它并不能在任何动物胃中定居。另一方面许多动物消化道中自然寄生着一些类似于Hp的细菌，这给在实验动物中识别Hp与类似菌造成困难。下面我们来看一看已经发现的Hp类似菌在自然动物中感染情况和已建立的Hp感染动物模型及其应用的现状。

　　1 Hp类似菌的自然感染

　　早在19世纪末有在狗、猫、棕色的挪威鼠胃中发现了螺形菌。但未在人、猴、牛、猪、小鼠、鸽子、乌鸦中找到。由于当时仅凭形态学判断，因此这些结果都未能肯定下来。直到1983年Marshall从人胃中分离到幽门弯曲菌（Campylobacter pylori,CP)后，才引起人们注意到此菌与慢性胃病的关系。同时亦引发人们对各种动物胃中类似菌的兴趣。1989年Goodwin对CP作了深入研究后，认为CP不同于弯曲菌属细菌，提出了一个新属名螺杆菌（Helicobacter），并确定Cp是这一属中的代表菌种，称作幽门螺杆菌（H.pylori, Hp）,同时亦把从雪貂胃中分离到的类似菌H.mustelac(Hm)，包括在这一属中，H属最主要的特征是指这一类细菌属革兰阴性、螺旋形、有带鞘的鞭毛。微需O₂尿素酶^（+）。有特殊的脂肪酸组成等。自此以后，人们从不同种类动物的消化道中发现了不下10余种H属细菌。最早分离到的可能是大鼠和小鼠肠道中分离到的H.muridarum.已知有6种H菌从不同动物胃里分离到。除Hp与Hm外。尚有猫狗中的H.felis(HF)，卷尾猴中的H.nemetrinae，猎豹中的“H.acinonyx”和狗中的H.bizzozero。原来归在Campylobacter属里的与人类胃肠炎有关的类似菌，H.cinaedi、H.fennelliac和H.heilmanii亦已归入此属。“Flexispira rappini”最早是在流产羔羊中分离到的细菌，最近亦在胃肠炎的病-人和小猎兔犬胃中发现。虽然这一细菌表现型上与Hp有差别，但根据产生尿素酶和基因型的特征已归入此属，称作“h.rappini”。除此之外尚有一些在动物下消化道中发现的，例如，引起小鼠肝炎的H.hepaticus等。

　　在人类或动物胃中除了Hp类似的细菌外，还有一些紧密螺旋形的细菌。例如：人胃中的人胃螺菌“Gastrospirillum bominis”，由于它们尚未能分离培养，对它们的生物学性状尚未充分了解，因此有的尚未正式命名。Henry就曾报告在小猎兔犬的胃粘膜电镜下曾显示三种形态的细菌：第一种是H.rappini，第二种H.felis，第三种是 “G.hominis”，用特探针发现三者有明显的差别。还有一些未曾命名的H属细菌已经在燕鸥、家雀和猪中发现。有人还在雪貂中发现不同于Hm的H属细菌。在这同时亦有人报道从猴类动物及猫中直接分离到Hp。由此可以想像研制Hp感染动物模型的复杂性。

　　2 Hp感染的动物模型

　　1983年后许多学者企图在常规实验室动物包括小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、无菌（Germ Free,GF）级无菌大鼠中用口服攻击法建立Hp感染的动物模型，结果均未成功。1987年krakowka考虑到猪的杂食性及其胃的解剖结构生理功能与人类相似，另一方面为了尽可能避免有可能干扰Hp感染成功的种种因素，他们成功地用GF级小猪口服接种Hp，建立了Hp感染的悉生（kontbiotic)动物模型。他们除了在此动物胃中重新分离到Hp外，亦观察到了由Hp感染引起的类似于人类感染Hp后引起的疾病的特征。接着亦有人用无特种病（specific-pathogen-free）,SPF）级的小猎兔犬中用口服Hp，亦建立了悉生犬类动物模型。由于建立较大型动物的悉生动物模型条件较困难，较难于推广应用。有人企图口服接种Hp于GF级的BALB/c小鼠和GF级的Sprague-Dowley大鼠建立动物模型，但未能成功。后来Lee用HF接种于GF级的Swiss Webster小鼠，2周内出现了急性炎症反应，3周后转为在人类感染Hp后出现的类似的慢性炎症过程。由此，第一次在小动物中建立了类Hp感染的悉生动物模型。1992年Karita用BALB/c裸鼠口服接种Hp获得成功。用这一裸鼠的动物模型，不仅能维持20周，而且能观察到胃炎、十二指肠炎及所有感染动物中所能观察到的一切病理学证据。雪貂是一种产于北美、北欧、与南太平洋地区的动物。它的胃的解剖生理学特征与人类相似，且饲养管理较方便，价格并不很贵。成年貂几乎100%感染了HM（它的生物学特性与Hp近似），且亦能引起胃炎、溃疡等病变及相关的免疫反应。因此，Fox推荐亦可把它用作替代Hp感染的动物模型。尽管前面已经介绍了几种不同类型的动物模型，但是迄今仍然可以说尚没有能普遍被接受。因为由GF级动物制成的动物模型，不仅需要有昂贵的设备的设备条件、复杂的饲养管理、操作手段。因此用这类动物模型亦仅能解决某些特定条件下的问题。裸鼠也是一种有免疫缺陷的小动物，饲养管理当然比GF级动物容易一些，但由于较小，实验观察亦有它有便的地方。而且它只对Hp的新鲜分离株敏感，对实验室株不敏感。有Hm和Hf株建立的动物模型，尽管与Hp感染相似，但毕竟不是Hp，因此用这类细菌感染的实验动物亦有它的局限性。Dubois等根据现有的文献资料通过表现型与基因型分析从恒河猴胃中分离到Hp样细菌与人类的Hp高度同源，因此观察了26只族群繁殖的猴群的自然感染史，取胃粘膜活检作病理切片及细菌分离培养。发现13只感染了Hp，9只感染了（G.hominis样细菌，GHLO），其中3只兼有两种细菌。而4只未感染上述两种细菌，未感染和只感染了GHLO的动物中胃炎的比数≤1:5，在所有感染了Hp的动物中胃炎的比数≥2.0。在13只Hp感染的动物中有12只具有相应的IgG，13只Hp阴性的动物中仅有2只具有IgG比例≥0.5（P＜0.001）。在实验观察期间，一只猴子感染上了Hp，同时发生胃炎和血浆IgG水平的升高。在未感染的动物中，感染胃炎、血浆IgG水平保持7～15个月不变，在6个月时6只猴子用三联疗法根除了Hp，随之降低了胃炎和血浆IgG的浅水水平。Dubols从他的实验中认为隐匿Hp的恒河猴伴有持续的感染、胃炎及特异性抗体水平的升高。所有这些都对适当的治疗作出反应。而GHLO感染很少有炎症相伴，因此提出自然感染Hp的恒河猴亦可作为人类Hp感染的动物模型。

　　3 动物模型的应用

　　3.1 抗Hp疗法疗效研究 在前述Dublos用自然感染Hp的恒河猴做实验。不仅证明了它可以用作Hp的动物模型，亦是用Hp感染动物模型研究抗Hp疗法疗效的典型例子。他在第一个试验中用溶介在Tang溶液中的Amoxicillin+Metronidazole+Bismuth Subsalicylate给6只恒河猴、2只感染Hp，4只感染GHLO治疗4周。在两组中均未观察到可以检测到的变化。作者的结论认为这一疗法对根除Hp毫无疗效。在另一试验中，同样药物对6只恒河猴每天胃内给予2次，连续10d，在第5d和1个月时都已证明清除了细菌，2个月后有2只猴子又发现了Hp感染表明可能是复发或再感染。其他4支动物直到治疗后6月仍然保持阴性，由此被认为，感染是被根除了。3个动物在治疗前也有GHLO感染，治疗5d后GHLO转为阴性，但是，一个月后，3只动物重新发现GHLO感染的证据。在第3个月时，另一个动物也出现GHLO。直到第5和第6个月时，所有4个猴子虽然都清除了它们的Hp感染，但增保持了GHLO的感染。治疗后一月胃炎程度比开始时下降，在4个根除Hp的恒河猴中的胃炎比≤1.0，而在2个复发Hp感染的动物中胃炎比恢复到＞2.0。经过治疗后在Hp根除的动物中血浆IgG比例逐渐下降。在2个未根除Hp的动物中保持不变。由此，它像在人类中一样，根除Hp后，胃炎和免疫抗体逐渐消失了。

　　3.2 在研究Hp致病机理方面的应用Eaton等用来自四窝23只悉生小猪以有动力和无动力的Hp株攻击。发现动力最强的感染率最高，达100%，动力最弱的感染率最弱，仅有17%，动力居中间的感染率达40%，从悉生小猪分离的Hp，动力比攻击株更强，攻击株产生的细胞毒素亦不相同，动力最弱的株产生最小量的细胞毒素，而其他两株均产生较高水平的细胞毒素，而其他两株均产生较高水平的细胞毒素。由此，悉生小猪中Hp的毒力与动力相一致，而与细胞毒素的产生不完全一致。

　　Tsuda等从病人身上分离到的Hp野生株CPY3401，用一个耐卡那霉素的决定簇基因插入到其尿素酶的基因中，使其变成一个无尿素酶活性的Hp突变株Hp173。然后，用CPY3401与Hp173两个同源株去攻击裸鼠，企图证明尿素酶的致病性。结果在CPY3401攻击的胃出现了胃炎，且由此动物分离到的Hp与原来攻击株地区别。而Hp173攻击的动物不发生胃炎，而且不能分离到Hp在裸鼠胃中定居的重要因子。

　　3.3 在研究免疫反应中的应用 为了说明Hp尿素酶亚单位作为粘膜免疫原的效率。Ferrero等用相当与Hp和Hf的尿素酶亚单位（UreA和Urab）编码基因克隆到表达载体（pMAL）中去使大肠杆菌表达出转译的合成蛋白质。重组的UreA和UreB蛋白质与粘膜佐剂（霍乱毒素、CT）结合，经口免疫小鼠。然后取胃粘膜活检作尿素酶试验和病理组织学检查。结果证明不管是同源性还是异源性的UreA均能在小鼠中引起抗HF感染的保护性反应。Ferrero认为通过本实验能证明重组亚单位抗原能引起抗H属细菌感染的免疫保护反应。

　　Lee为了确定低剂量的CT或它的B亚单位（CTB）在H属细菌口服疫苗中作为一个佐剂是否有效。他在下述三组免疫的APF级BLAB/c小鼠中完成对活的HF攻击的明显的保护作用。①HF抗原+0.5μgCT和10μgCTB(96%)；②HF抗原+0.5μgCT(45%)；③HF抗原+10μgCTB(85%)。单独用HF抗原或单独用佐剂免疫小鼠无任何保护作用。用HF抗原+10μgCT免疫小鼠对HF攻击只有26%的保护作用。这预示无毒的CTB佐剂将可用于人类的免疫中。

张振华

上海第二医科大学微生物学教研室（200025）