胃幽门螺杆菌感染患儿细胞毒素相关基因A和细胞空泡毒素A与十二指肠疾病

中华儿科杂志 1999年第9期第0卷 论　著

作者：许春娣　季月华　陈舜年　江石湖　徐家裕

单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院

关键词：螺杆菌；幽门；十二指肠溃疡；胃炎；螺杆菌感染；细胞毒素类

　　【摘要】　目的　了解幽门螺杆菌(Hp)阳性患儿感染的Hp菌株类型，探讨细胞毒素相关基因A(CagA)、细胞空泡毒素A(VacA)与小儿慢性胃炎、消化性溃疡病发生之间的关系。方法　采用免疫印迹法对33例十二指肠溃疡、31例慢性胃炎患儿做血清Hp的116 000(CagA)、89 000 (VacA)、35 000、30 000、26 500和19 500蛋白抗体的检测。结果　在十二指肠溃疡患儿89 000检出率达72%，而慢性胃炎仅为23%，但CagA在溃疡与胃炎患儿中差异不显著。以CagA、VacA结合分型发现，在十二指肠溃疡患儿69%的Hp为CagA⁺、VacA⁺菌，而在慢性胃炎中68%的Hp为CagA⁺、VacA^-菌，两者比较差异有显著性（P＜0.05）。结论　小儿十二指肠溃疡及中、重度胃炎的发生与感染Hp的毒力菌株相关，VacA很可能是致溃疡的毒力因素。

Serum CagA and VacA detection and Helicobacter pylori associated gastroduodenal disease

XU Chundi, JI Yuehua, CHEN Shunnian, et al.

　　Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

　　【Abstract】　Objective　To study the strains of Helicobacter pylori (Hp) in infected children and relationship between Hp CagA and VacA and gastroduodenal disease development.Methods　The serum 116 000 (CagA), 89 000(VacA), 35 000, 30 000, 26 500 and 19 500 of Hp protein were analyzed by Western blot in 33 duoderal ulcer (DU) and 31 chronic gastritis patients.Result　The detection rate of 89 000 was 72%, which was higher than that in gastritis patients (23%); CagA detection rate was not significantly different between DU and gastritis groups, CagA⁺ and VacA⁺ strain was 69% in DU group, CagA⁺ and VacA^- was 68% in chronic gastritis group. The differences between the groups were very significant.Conclusion　Children′s DU and gastritis, particularly the moderate and severe ones were associated with Hp virulent strains. The VacA might be the virulent factor causing ulcer.

　　【Key words】　Helicobacter pylori　　Duodenal　　Gastritis　　Helicobacter infections　　Cytotoxins

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的重要致病菌。但Hp进入体内后如何致病，其确切的致病机理，尚不清楚。近年来国外学者发现Hp的致病与否与感染的菌株类型有关，认为含细胞毒素相关基因A（cytotoxin associated gene A, CagA）的Hp菌株是胃十二指肠溃疡的主要致病菌。CagA蛋白在消化性溃疡病中有非常高的检出率^［1,2］，与细胞空泡毒素A(vacuolating cytotoxin,VacA)有密切关系，但其与小儿胃十二指肠疾病关系未见详细报道。本研究拟通过小儿Hp感染患儿血清CagA、VagA蛋白抗体的检测，了解不同上消化道疾病中Hp的菌株类型，探讨CagA、VagA与小儿慢性胃炎、消化性溃疡病发生之间的关系。

　　对象及方法

　　一、对象对象

　　33例十二指肠溃疡，年龄5～14岁，男性22例，女性11例。31例慢性浅表性胃炎，其中慢性活动性胃炎及中度以上胃炎21例，男性14例，女性17例，年龄4～12岁。剔除了近期有服用抗生素及非甾体类药物(NSAIDs)的患儿。

　　上述患儿均采用日产富士能电子小儿胃镜作常规胃镜检查，完毕后再取胃窦活检粘膜至少4块做Hp的W-S银染色、快速尿素酶试验、Hp培养及病理检查。凡W-S银染色和快速尿素酶试验阳性或Hp培养阳性者定为Hp感染。胃镜检查后采肘静脉血2 ml，分离血清后置-20℃保存备用，统一检测。

　　二、方法

　　采用免疫印迹法，Helico blot 2.0 Kit，由新加坡Genelabs Diagnostics公司提供。

　　实验步骤：将含有Hp抗原的蛋白印迹条带，置入反应板槽内，加入灭能后的待检血清，按免疫印迹法的常规方法检测Hp抗体IgG，每次检测均设阳性对照、阴性对照及空白对照。

　　结果

　　一、 免疫印迹检测结果

　　在血清标本中，共检出与Hp感染诊断相关的6条反应条带即116 000、89 000、35 000、30 000、26 500和19 500，其中的116 000与89 000分别代表CagA和VacA，30 000代表尿素酶A，其余则显示为Hp菌体的小分子蛋白。在免疫印迹识别反应中各条带在不同疾病中的检出率列于表1，从表中看出，在十二指肠溃疡患儿中19 500条带检出率低于胃炎，而89 000条带高于胃炎，差异有极显著性，P均＜0.01，35 000条带虽高于胃炎，但差异尚未达显著界值，其他条带差异均无显著性。

表1　各免疫印迹条带在不同胃肠病中检出率

　　^* P＜0.01，^** 为精确检验P值

　　二、Hp感染的菌株血清分型

　　从表2可见，无论溃疡还是胃炎Hp血清分型CagA和VacA间均无明显的一致性，P均＞0.05；溃疡病两型的检出率差异亦无显著性，但胃炎患儿Hp以CagA检出高于VacA，经McNemar χ²(χ²m)检验，χ²m=13.067，P＜0.001。

表2　不同胃肠病Hp感染患儿菌株血清分型

　　^*为精确检验P值，^** P＜0.01

　　两病Hp分型构成差异有极显著性，χ²=40.336，P＜0.001，溃疡病以CagA和VacA均阳性多见（占69.0%），而胃炎以CagA(+)VacA(-)居多（68.2%）。

　　三、诊断Hp感染的常规方法与免疫印迹法比较

　　Hp的粘膜组织活检方法、免疫印迹法与血清ELISA方法比较见表3、表4。从表中可见，血清免疫印迹法Hp感染的诊断方法与粘膜活检法相接近，而在消化性溃疡病时检出率高于ELISA法（χ²=5.279，P＜0.05）。

表3　免疫印迹法与粘膜活检、ELISA法诊断Hp结果对照

　　^* P＜0.05

表4　三种检测方法对Hp检出率的比较

^* P＜0.05

　　讨论

　　一、Hp感染诊断方法选择

　　自Warren和Marshall于1982年报告分离出Hp以来，国内外很多学者相继证实Hp与慢性胃炎、消化性溃疡密切相关。Hp感染的检测方法很多，但细菌培养、组织染色法和尿素酶试验均需胃镜活检取材，且取材非常局限。同位素标记的¹³C、¹⁴C呼吸试验虽为非侵入性方法，但¹³C需要昂贵的仪器设备，¹⁴C又具有放射性，在儿童中应用受到了限制，因此目前逐步在发展用血清学方法诊断Hp感染。

　　Hp的血清免疫印迹法是一种特异、敏感而稳定的检测蛋白质方法，它能定性地分析Hp各蛋白质的组分。Helico Blot2.0应用了国际公认的Hp菌株抗原（包括高毒力株表达的特定蛋白组分），因此，在本研究中，我们用该法与粘膜活检法（尿素酶、培养、W-S银染色）作了比较，发现其诊断精确性无明显差异（在溃疡与胃炎患儿中，P＞0.05）。与使用全菌体作抗原的血清ELISA法比较，则显出更多的优势，即ELISA法只能提示有无Hp感染，而免疫印迹法则还能提供感染Hp的菌株类型是否含有CagA与VacA，是否为致病菌株，有助于Hp的致病性研究。

　　二、Hp菌株分型与致病性

　　在本研究中，我们将不出现任何条带或只出现与阳性不同位置的条带时判为阴性，单纯Hp抗体阳性者为有35 000、30 000、26 500和19 500中任何两条，Hp的高毒力株抗体阳性者为有116 000和89 500或任何一条。结果显示，在小儿十二指肠溃疡患儿中，血清学诊断Hp感染率为88%，在31例慢性胃炎中Hp感染率为71%，CagA抗体检出率在Hp阳性溃疡和中重度慢性胃炎中占91%，而有细胞空泡毒素的Hp菌株在十二指肠溃疡病者占72%，而在慢性胃炎中仅占23%，二者比较差异有显著性（P＜0.05），可见细胞空泡毒素与十二指肠溃疡的发生密切相关，是致小儿溃疡病的重要毒力因素。近年来，国内外学者根据Hp的不同毒力，将临床上分离的Hp菌株分为两大类：Ⅰ型细菌为高毒力株，含CagA基因，可同时表达CagA蛋白和VacA蛋白，产生空泡毒素与疾病密切相关。Ⅱ型细菌为低毒力株，有VacA基因，但不含CagA基因，不产生CagA蛋白和空泡毒素，另外有二种细菌表现为中间型，仅含有一个与疾病有关的毒力因素VacA或CagA^［3-5］。现认为十二指肠溃疡的形成与产生空泡毒素Ⅰ型细菌感染密切相关。本研究结果与国外成人报道相似，在十二指肠溃疡患儿中感染Ⅰ型的Hp菌株更多见。关于Hp VacA毒素致十二指肠溃疡的机制尚未明确，但有文献报道VacA在酸性环境下会被激活，激活后的VacA能抵制pH 1.5的酸和胃蛋白酶的消化，并在中性环境中保持长时间的活性，还可通过幽门进入肠腔，活化的VacA在未被肠内一些蛋白酶消化前，即引起十二指肠上皮细胞的空泡形成，于是在十二指肠缺乏Hp存在的条件下导致十二指肠溃疡^［6,7］。从而形成了Hp致十二指肠溃疡形成的漏屋假说机制（leaking roof hypothesis）。

　　本研究结果说明，小儿十二指肠溃疡及中、重度胃炎的发生与感染Hp的毒力菌株相关，CagA与VacA是致小儿慢性上消化道疾病重要的毒力因素，当血清中检测到Hp的CagA时，提示小儿感染的Hp菌株系毒力株，而VacA也同时阳性，则表明感染的菌株与溃疡有关，即患儿有发生溃疡的可能，应进一步检查并给予治疗。此外在本研究中发现溃疡患儿的19 500明显低于胃炎，其中的意义不太清楚，亦无文献报道,有待今后深入研究。

　　参考文献

　　1　Weel JFL, Wanderhulse RWM, Philiproorda YG, et al. The interrelationship between cytotoxin-associated gene A, vaculating cytotoxin and Helicobacter pylori-related disease. J Infect Dis, 1996, 173: 1171-1175.

　　2　Grabtree JE, Taylor JD, Wyatt JI, et al. Mucosal IgA recognition of Helicobacter pylori 120Ua protein, peptic ulceration and gastric pathology. Lancet, 1991, 338: 332-335.

　　3　Tee W, Lambert JR, Dwyer B. Cytotoxin production by Helicobacter pylori from patients with upper gastrointestinal diseases. J Clin Microbiol, 1995,33:1203-1205.

　　4　Crabtree JE, Figura N, Taylor JD. Expression of 120-klodalton protein and cytotoxicity of Helicobacter pylori. J Clin Pathol,1992,45:733-736.

　　5　Tummuru MKR, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun, 1993,61:1799-1809.

　　6　McGuigan JE. Helicobacter pylori: the versatile pathogen. Dig Dis, 1996, 14: 289-303.

　　7　Bernard MD. Low pH activates the vacuolating toxin of Helicobacter pylori uhich becomes acid and pepsin resistant. J Biol Chen,1995,270:23937-23940.

(收稿：1998-11-26　　修回：1999-05-17)