月经周期中子宫内膜内皮素及其受体的研究

中华妇产科杂志 1998年第10期第33卷 论著

作者：王桂敏　郑淑蓉　范正红

单位：100034 北京医科大学第一医院妇产科研究室［王桂敏（现在河北医科大学解剖教研室），郑淑蓉，范正红］

关键词：子宫内膜；内皮缩血管肽类；受体；内皮缩血管肽；月经周期；免疫组织化学；原位杂交

　　【摘要】　目的　评价内皮素(ET)在内膜生殖生理中的作用。方法　利用免疫组织化学和分子原位杂交结合计算机辅助图象分析技术，检测23例因良性疾病而行子宫切除术的子宫内膜ET肽、ET受体及其两种亚型(ETaR、ETbR)的mRNA表达定位、周期性变化。结果　在整个月经周期中子宫内膜ET肽和ET mRNA表达有明显的周期性变化, 分泌期表达强于增殖期，分泌晚期腺上皮表达最高。基质表达弱于腺上皮，并无明显的周期性变化。ETaR和ETbR广泛分布于内膜，腺体表达高于基质。ETbR mRNA表达在分泌期高于增殖期, ETaR　mRNA表达无明显的周期性变化, ETaR/　ETbR比值有明显的周期性改变。结论　 ET可能促进内膜剥脱后腔上皮和腺上皮的再生和修复，并对内膜血管床发挥旁分泌调节作用。

　　The Study of Endothelin and Endothelin Receptors in Cyclic Human Endometrium　Wang Guimin^*, Zheng shurong, Fan Zhenghong. ^*　Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017

　　【Abstract】　Objective　 To determine the distribution of endothelin (ET) peptide and endothelin as well as their receptors (ETaR and eTbR) mRNA in human cycling endometrium in order to assess possible role of ET in endometrial reproductive physiology. 　Methods　Twenty-three endometrial specimens from gynecological surgery for benign conditions were studied by means of immunohistochemistry , in situ hybridization and computer quantitative image analysis.Results　The expression of ET peptide and ET mRNA in human endometrium varies throughout the menstrual cycle, increasing gradually from proliferative phase to secretory phase, with maximal levels in the pre-menstrual phase. Stromal expression is lower than in glandular epithelium and remains relatively constant in the menstrual cycle. ETaR and ETbRmRNA are detected in normal human endometrium, higher in glandular epithelial cells than in stromal cells. ETaR mRNA expression has no obvious cyclic changes, but ETbR mRNA expressions are higher in secretory endometrium than in proliferative endometrium. The ratio of ETaR/ETbR has also cyclic changes.Conclusion　Changes of Expression of ET and ET receptors in the endometrium throughout the menstrual cycle suggest that ET might be important in endometrial regeneration and repair following menstruation, and probably plays a role as the paracrine control of the uterine vascular bed.

　　【Key word】　Endometrium　　　 Endothelin　　　　 Receptors，endothelin　　　Menstrual cycle　　　Immunohistochemistry　　　In situ hybridization

　　月经出血、止血和异常子宫出血的机理，迄今尚未完全阐明。卵巢激素和激素受体虽与这些过程有关，但不能解决这些过程中的所有问题^［1］。已知螺旋动脉的强烈收缩与内膜腔上皮的再生和修复在月经出血与止血中发挥重要作用^［2，3］。然而，卵巢激素在体外并无直接的缩血管作用，提示内膜局部产生的血管活性物质在这一过程中发挥作用。内皮素(ET)是近年来发现的一种作用极强的缩血管活性肽。除内皮细胞外，某些上皮细胞也可产生ET，并具有广泛的生物学效应^［4］。例如，ET作为一种促有丝分裂剂，还可以促进平滑肌细胞和成纤维细胞增殖。因此，ET与内膜生理功能调节，特别是与月经出血与止血的关系，引起了研究者的关注^［5］。本研究利用免疫组化和原位杂交结合计算机辅助图象分析技术，对正常妇女月经周期中子宫内膜ET和ET受体的表达部位和生成规律，进行定位和半定量研究，了解它们在内膜生殖生理和病理中的作用。

资料与方法

　　一、资料来源

　　1995年10月到1996年10月在北京医科大学第一临床医院妇科因良性疾病而行子宫切除术的患者30例，年龄32～48岁。术前3个月未用过激素类药物，未放置宫内节育器，月经规律正常。根据Noyes等^［6］的内膜评分标准确定内膜的组织分期，其中7例因内膜的组织分期与月经资料不符而被舍去。23例入选者中浆膜下肌瘤3例，壁间肌瘤8例，腺肌症和子宫内膜异位症各6例，术后立即取宫底处内膜，4％多聚甲醛固定。石蜡包埋，5 μm厚切片。

　　二、方法

　　1. 免疫组化:兔抗人ET-1多克隆抗体为美国Peninsula公司产品。生物素化羊抗兔IgG和辣根酶标记的链酶亲合素购自北京市中山生物技术有限公司。主要步骤按免疫组化ABC法。以磷酸缓冲液代替一抗作阴性对照。选用同一已知阳性强度的组织片做内参照。结果判定：ET免疫反应呈棕黄色颗粒位于胞浆内，方法对照片无着色。由同一观察者对切片进行评分。参照Marsh等^［7］评分标准，根据染色强度分为0(阴性)～4级(最大染色强度)，为分析方便将其转换为百分比表示，即0～4级分别为0%、25%、50%、75%和100%，由此计算均数和标准差。内参照片平均批间变异系数小于10%。

　　2. 原位杂交:ET-1质粒由美国田纳西大学西南医学中心M.Linette Casey教授馈赠。ET受体质粒由日本京都大学医学院Shigetade Nakanishi教授馈赠。按参考文献［8］中介绍的方法提取质粒DNA。采用德国宝灵曼公司地高辛标记DNA试剂盒和核酸检测试剂盒，随机引物法标记探针。原位杂交基本步骤为：二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蛋白酶K(40 μg/ml)消化，4%多聚甲醛后固定，预杂交，杂交(探针浓度2 ng/ml)，杂交后冲洗，滴加绵羊抗地高辛精抗体(1∶500稀释)，缓冲液冲洗，避光显色，封片。用预杂交液代替杂交液作阴性对照。结果判定：ET、ET受体亚型a(ETaR)和ET受体亚型b(ETbR)mRNA阳性反应呈紫蓝色颗粒位于胞浆，方法对照片无着色。选用同批杂交切片应用德国IBAS-2000型图象分析仪分别测试基质和腺体阳性反应所占各自成分的面积百分比及平均吸光度(A)。分别代表阳性反应的表达范围和强度。每张切片随机测量5个视野，至少计数1 000个细胞。

　　三、统计学方法

　　用GraphPAD软件(San Diego, California, 美国)做单因素方差分析。

结果

　　一、ET免疫活性物质表达的周期性变化

　　月经周期中，子宫内膜腺上皮和腔上皮ET免疫染色有明显的周期性变化。分泌期染色强于增殖期，尤其是经前期染色最强。基质染色明显弱于腺体，其着色强度无明显的周期性改变(图1,2)。分泌中、晚期腺体ET免疫染色明显高于增殖期, 分泌晚期表达最高(P＜0.05, P＜0.01)。基质ET染色明显弱于腺体，虽然在分泌期染色有增强趋势, 但各期之间差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

表1　子宫内膜ET-1肽表达周期性变化的

　　免疫组化评分(％，±s)

　　二、ET-1 mRNA表达的周期性变化

　　在整个月经周期中，子宫内膜腺体、基质和血管均可检测到ET-1 mRNA (图3～5)，其表达定位和周期性变化与ET-1肽基本一致。分析表明，月经周期中内膜腺体ET-1 mRNA的表达明显高于基质，分泌中、晚期高于增殖期(P＜0.05, P＜0.01), 以分泌晚期表达最高。基质ET-1 mRNA的表达范围虽无明显的周期性改变,　但其表达强度(A)在分泌中、晚期高于增殖期(P＜0.05)，有周期性变化。见表2。

表2　子宫内膜ET-1 mRNA表达的周期性变化

象分析结果(±s)

　　三、ET受体mRNA表达的周期性变化

　　内膜腺体、基质和血管均表达ET受体mRNA，但ETaR主要位于腺上皮，其着色强度无明显的周期性变化。ETbR既位于腺上皮也位于基质, 分泌期腺体着色明显高于增殖期(图6,7)。内膜腺体ETaR mRNA的表达明显高于基质，在分泌期腺体和

表3　子宫内膜ETaR和ETbR mRNA表达的周期性变化图象分析结果(±s)

　　基质ETaR mRNA的表达范围和强度均高于增殖期, 但差异无显著性；腺体ETbR mRNA的表达分泌中、晚期明显高于增殖期, 以分泌中期表达最高(P＜0.01，P＜0.05), 但基质的表达范围和表达强度与增殖期比较差异无显著性。ETaR与ETbR比值在增殖期明显高于分泌期。见表3。

讨论

　　免疫组化和聚合酶链反应研究证实，子宫内膜表达ET肽、ET-1和ET受体mRNA^［5，9］。但对其在子宫内膜的准确来源和作用部位尚有争议。Casey等^［10］研究表明，培养的腺上皮和基质细胞均分泌免疫活性ET，基质产生的ET可能以旁分泌方式从血管的外膜面作用于血管发挥作用。但Marsh等^［5］发现，原代培养的腺上皮细胞和培养液中可检测出免疫活性ET-1，但培养的基质细胞和其培养液ET阴性，认为内膜ET来源于上皮细胞。

　　本研究表明，ET和ET受体在子宫内膜的分布具有广泛性、不均一性和周期性的特点。但无论是ET 还是ET 受体均以腺上皮表达最高。提示，腺上皮是内膜ET的主要生成和作用部位。尽管ET的两种受体亚型在内膜的作用还不清楚，但ETaR/ETbR比值的周期性改变很可能与靶细胞的生物学效应有关。我们推测，内膜腺上皮细胞产生的ET可能作为一种丝裂原，通过自分泌的方式作用于自身，在月经剥脱后内膜腔上皮和腺上皮的再生修复中发挥作用。增殖期内膜腺上皮高水平的ETaR很可能与腺上皮细胞的增殖有关，而分泌期高水平的ETbR很可能与腺上皮细胞的分化有关。如果此假设成立，那么，任何原因（如使用避孕药等）导致内膜腺上皮ET生成的减少，就可能损害内膜的再生修复功能，内膜再生修复不良、结构脆弱很可能与异常子宫出血的发生有关。有必要进一步观察ET对培养的腺上皮和基质细胞增殖和分化的影响，以证实其在内膜生殖生理中的准确作用。

　　本研究还表明，子宫内膜ET免疫活性物质的表达定位和周期性变化，与ET-1 mRNA的表达定位和周期性变化基本一致。内膜腺上皮ET免疫活性物质和mRNA的表达均在分泌期高于增殖期，以经前期表达最高。基质ET免疫活性物质的表达周期性变化虽不明显，但其mRNA的表达分泌期高于增殖期。表明，内膜ET生成的周期性变化特点恰与子宫血流量的周期性变化规律一致。分泌期内膜腺体和基质较高水平的ET，很可能以旁分泌方式作用于内膜小血管，参与内膜局部血流量的调节。但经前期子宫内膜的高ET环境是否与月经始动、经血量控制和经期止血有关，还有待进一步研究。

图1　增殖期内膜ET免疫活性物质表达呈弱阳性。免疫组化ABC×200

2　分泌晚期内膜腺体ET免疫活性物质表达呈强阳性。免疫组化ABC×200

图3　增殖期内膜ETmRNA表达阳性。原位杂交×200

4　分泌晚期内膜腺体ETmRNA表达呈强阳性。原位杂交×200

5　阴性对照染色切片。原位杂交×200

图6　增殖期内膜腺体ETaR mRNA表达呈强阳性。原位杂交×200

7　分泌晚期内膜腺体ETbR mRNA表达呈强阳性。原位杂交×200

参考文献

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　　10　Casey ML， MacDonald PC. Modulation of Endometrial blood flow: regulation of endothelin-1biosynthesis and degradation in human endometrium. In: Alexander NJ， d'Arcangues C, eds. Steroid hormones and uterine bleeding. Washington： AAAS Press，1992. 209-224.

(收稿：1997-11-24　　修回：1998-08-07)