丙型肝炎病毒抗药性的研究进展

　　摘要 慢性丙型肝炎病人在接受标准的抗病毒治疗，即α-干扰素联合利巴韦林治疗后，仅有40%的病人可取得持久的病毒学应答，HCV的抗药性已成为当前慢性丙型肝炎治疗的主要问题。本文就HCV对抗病毒治疗（主要为α-干扰素治疗）产生抗药性的原因和机制进行了概述。

　　丙型肝炎病毒（HCV）会对抗病毒治疗产生抗药性，使约60%的慢性丙型肝炎病人在接受标准的抗病毒治疗，即α-干扰素联合利巴韦林（ribavirin）治疗后，仍不能清除体内的HCV，导致治疗失败。因此，HCV的抗药性已成为慢性丙型肝炎治疗的主要问题。本文就HCV对抗病毒治疗（主要为α-干扰素治疗）产生抗药性的原因和机制概述如下。

　　一、 HCV抗药性及其发生率

　　理论上，抗病毒治疗最理想的结果是把HCV从体内清除，肝功能恢复正常，肝脏组织学得到明显改善。在临床上，理想的治疗结果通常指达到持久的病毒学应答（sustained virological response，SVR），即抗病毒治疗结束后随访6个月或以上，仍保持HCV RNA阴性。达到SVR时一般血清谷丙转氨酶也可保持正常。如在抗病毒治疗后，HCV RNA仍持续阳性，则意味着HCV对抗病毒药物产生了抗药性（resistance）。迄今为止，目前国际上公认有效的主要的抗HCV药物仍是α-干扰素，但其疗效不能令人满意。Thevenot 等[1]对近期的76随机对照临床试验进行了Meta分析，α-干扰素300万单位，T.I.W×12个月，治疗结束时的病毒学应答率(end-of-treatment response， ETR) 为39%(对照组为1%)， SVR仅为17%(对照组为3%)。联合利巴韦林后，SVR可提高到40%左右，但仍有约60%的慢性丙型肝炎病人对抗病毒治疗产生抗药性，尤其在基因型为1型，治疗前病毒负荷（viral load）的慢性丙型肝炎病人中，HCV的抗药性更加明显。

　　尽管已经肯定，利巴韦林与α-干扰素联合使用，可明显提高后者的疗效，但其确切机制尚不清楚，目前认为利巴韦林主要通过增强α-干扰素的免疫调节而发挥作用。因此，HCV对α-干扰素与利巴韦林联合应用的耐药机制和对α-干扰素单独应用的耐药机制是相同的，即HCV的抗药性主要表现为对α-干扰素的耐药。

　　在临床上，HCV的抗药性可表现为4种不同的类型[2]：①应答-复发型（responder-relapser）。在抗病毒治疗时，血清HCV RNA阴性，停药后很快转为阳性；②应答-突破型（responder with breakthrough），指抗病毒治疗过程中HCV RNA一度转为阴性，但尚未停药就转为阳性；③部分应答型（partial responder），表现为在抗病毒治疗过程中HCV RNA水平降低1log10以上，但不能转为阴性；④无应答型（nonresponder），表现为在抗病毒治疗过程中HCV RNA水平始终无明显变化。

　　二、 HCV对α-干扰素产生抗药性的原因

　　HCV对α-干扰素产生抗药性的原因是多因素的，与治疗方案、宿主和病毒本身因素均有关系。

　　1、治疗方案 α-干扰素单独应用时，疗效有限，利巴韦林单用对SVR基本无影响，而两者联合可明显提高疗效。正因如此，目前国际上已经把α-干扰素与利巴韦林联合使用作为慢性丙型肝炎标准的治疗方案。即使以前用α-干扰素治疗复发的病人，再次用此方案治疗，也可使部分病人达到SVR。Cavalletto等[3]给50例单用α-干扰素治疗复发者采用联合治疗方案（α-干扰素600万单位，T.I.W×2个月， 随后α-干扰素300万单位，T.I.W， 联合利巴韦林×6个月），达到SVR者为44%，而单用者为16%。

　　目前的联合治疗方案中，α-干扰素基本是隔日应用。由于α-干扰素的半衰期短，而体内新产生HCV的量较大（可达1012个/日），HCV RNA水平通常在给药的第二日反弹，故这种给药方式不利于HCV的清除，可能为疗效不满意的原因之一。Fried等[4]将104名慢性丙型肝炎病人随机分为每日给药组和隔日给药组，在治疗结束时，每日给药组HCV RNA转阴率是隔日给药组的2倍，但每日用药给病人带来不便，且费用较高，副作用较大，故病人常难以接受。为了维持控制病毒复制所需的有效血液浓度，最近国外研制出一种长效α-干扰素（PEG干扰素），具有吸收和消除慢，分布范围有限等优点，可每周一次给药。系列临床试验结果表明，PEG干扰素单用（180ug/次），SVR可达30%~39%，而对照组（普通α-干扰素单用）的SVR仅为8%~19%，疗效明显优于普通制剂[5，6，7]。

　　α-干扰素的疗程对HCV抗药性的发生率也有明显影响。Pol等[8]报告，采用联合治疗方案治疗307例慢性丙型肝炎病人，疗程为12个月者，45.2%病人达到SVR，而疗程为6个月者仅为24.5%( P<0.05 )。多元分析的结果也表明，长疗程（12个月）为SVR的独立的预测因子之一[9]。

　　2、病人因素 一项1744个慢性病肝病人参与的临床试验发现[10]，黑人和西班牙人的SVR率（分别为11%和16%）明显低于白人和亚洲人（分别为27%和44%）。老年人、男性病人接受抗HCV治疗后，达到SVR的比例较低。病人的体重、病程对抗病毒治疗的效果也有影响，体重低（<60kg），病程短(<10年)有利于达到SVR[9]。

　　在用α-干扰素治疗过程中，约15%~23%病人可产生的干扰素中和抗体，但其与HCV抗药性之间的关系尚未肯定。，有研究认为[2]，部分病人发生的应答-突破现象，50%与诱导产生的干扰素中和抗体有关，此时改换其它品种的干扰素可提高SVR率。也有学者认为干扰素中和抗体产生与HCV抗药性无关[11]。

　　病人自身疾病的状况、有无合并症也对疗效有影响。当病人已有肝纤维化、代偿性肝硬化时，对抗病毒治疗的反应较低，而一旦发展到失代偿性肝硬化时，通常禁止进行抗病毒治疗。如慢性丙型肝炎病人同时合并HIV感染，对抗病毒治疗的反应也较低，尤其是CD4+细胞计数低的病人，HCV的抗药性更明显。可能与HIV引起的免疫抑制，病毒或药物之间的相互作用有关。合并冷球蛋白血症、膜增殖型肾小球肾炎者对抗病毒治疗的反应同样较低[2]。

　　对于以前单用α-干扰素治疗失败者，再治疗的效果与抗药性的临床类型有关，应答-复发型再用α-干扰素联合利巴韦林治疗的效果较好[9]，Cavalletto等报告[3]，SVR可达44%（α-干扰素600万单位，t.i.w.×2月， 300万单位，t.i.w联合利巴韦林×6月）。无反应型再治疗的效果较差，尽管不同学者报告的SVR的结果差异较大，但目前倾向于认为，再治疗的效果有限[3，12]。

　　3、病毒因素　近年来的研究发现，HCV基因型、HCV RNA水平、NS5A的序列及HCV准种的选择是影响抗病毒治疗效果的重要因素。

　　1）基因型　1型和4型HCV对α-干扰素的反应，与2、3型相比，相对较差，尤其是1型HCV对α-干扰素最差。单用α-干扰素治疗时，1、4型HCV感染者的SVR率仅为8%~15%，而2型HCV感染者的SVR率可达60%~70%，3型介于两者之间，为33%左右[13，14]。因此，HCV的基因型是α-干扰素疗效预测最重要的独立因素[9]。

　　2）HCV RNA水平 治疗之前HCV RNA水平高的病人，容易对α-干扰素产生抗药性。Barbaro等采用联合治疗方案或α-干扰素单用治疗428例慢性丙型肝炎病人，经多元分析发现，HCV RNA水平在3×106以下者，易达到SVR[15]。低HCV RNA水平是取得SVR的独立的预测因子[9]。

　　3）NS5A的氨基酸序列 近年来注意到，HCV编码区编码的非结构蛋白NS5A与肝细胞中的RNA依赖性蛋白激酶（PKR）之间的相互作用，可能决定着HCV对α-干扰素的敏感性。α-干扰素抗病毒作用的机制之一是诱导宿主细胞产生PKR，PKR激活后可使真核翻译启动子（elf-2α）磷酸化，从而导致蛋白合成终止，病毒死亡。研究发现[16]，NS5A的C端(aa2209~2248)存在着一种所谓的干扰素敏感决定区(interferon sensitivity determining region， ISDR)，ISDR及其下游的26个氨基酸残基序列是NS5A与PKR结合的关键结构区。同时也证实PKR分子中的一段序列（位于aa244~296之间）是与NS5A结合的关键位点。NS5A与PKR结合后使后者不能形成正常的同二聚体分子，妨碍了PKR对elf-2α的磷酸化修饰，从而使HCV对α-干扰素产生抗药性。如果ISDR的氨基酸发生变异，可影响NS5A与PKR的结合，使HCV对α-干扰素的敏感性和应答率提高。

　　Watanab等[17]研究了334例慢性丙型肝炎病人ISDR变异与对α-干扰素应答之间的关系，发现达到SVR者，其HCV的ISDR的变异数明显高于一过性应答和无应答者（P<0.001），其中aa2209、2216、2227位变异者，SVR率较高。Halfon等也发现，ISDR无变异及HCV-J株感染者无人达到SVR[18]。还有研究发现，有些病人对α-干扰素的反应尽管与ISDR的序列无关，但与ISDR下游的26个氨基酸变异及NS5A C端的另外两个变异区的氨基酸变异有关[19]。

　　目前，有关NS5A的ISDR序列与α-干扰素应答之间关系的研究报告较多，多数支持以上观点，但来自欧洲和北美的有些研究没有发现与α-干扰素应答有关的ISDR序列， 造成这一差异的原因尚不清楚。Witherell等 [20]根据以发表的文献，建立了675例慢性丙型肝炎病人ISDR序列的数据库，统计分析结果显示，ISDR序列与干扰素应答有明显的相关性。欧洲和北美的有些研究没有发现这种相关性的原因可能与样本数较少有关。

　　4）HCV种准 HCV的基因易发生变异，故HCV的基因序列呈高度异质性。HCV变异除产生不同的基因型、亚型、种之外，还产生多种序列组成有所不同但却有高度同源性的HCV变种，即准种（quasispecies）。整个HCV基因组范围内的变异均可产生准种，用于准种研究较多的区域为E2/NS1区的高变1区（HVR1）和NS5A区。HCV感染者体内可存在多个准种，在外界选择压力下，病人体内的HCV准种可发生改变。

　　近年来，对准种与干扰素应答之间的关系进行了较多的研究。通过对接受干扰素治疗慢性丙型肝炎病人的HCV HVR1片段进行单链构像多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）或（和）直接测序分析，发现治疗前HCV准种数少者，易达到SVR，治疗前准种数是独立的疗效预测的因子之一。含准种多者可因某些准种能逃逸干扰素诱导的宿主的反应而对干扰素治疗产生抗药性。并且，治疗过程中HCV可因基因变异而产生新的准种，以逃逸干扰素的作用[21，22，23]。

　　HCV准种影响干扰素疗效的确切机制尚不清楚。Pawlotsky认为[2]，病人体内并不存在对干扰素有固有抗药性的准种，证据是：①所有病人在接受足够剂量初始治疗后，由于干扰素的非特异抗病毒作用，HCV RNA水平均有明显的下降（至少在最初的数小时内）；②一些第一次用干扰素治疗失败者，再次给予干扰素治疗，部分病人仍可达到SVR；③迄今为止，在HCV基因组中并未发现引起抗药性的特殊基因变异。此外干扰素的抗病毒作用不是通过特异地作用于HCV的基因靶位实现的，而是通过增强宿主的抗病毒反应实现的。宿主的反应再反过来对HCV的各个不同的基因区、蛋白、表型等施加选择性压力，故干扰素作用的靶位很多，位于整个基因组。并且，不同病人之间，可因所感染的病毒毒株、宿主的遗传、免疫背景的不同，干扰素作用的靶位差异很大。因此， HCV准种对干扰素耐药，是选择的HCV准种适应了干扰素诱导下的宿主环境，逃逸特异性的宿主反应所致，而不是逃逸干扰素本身造成的。

　　也有不少学者对HCV准种与干扰素抗药性之间的关系持否定意见。Sandres[24]等根据病人的性别、基因型和治疗前HCV RNA水平等影响疗效的因子，对完全应达者和无应答者进行配对研究，对治疗前HCV HRV1区片段进行克隆和测序分析，结果发现，HVR1区的复杂性（准种的数目）与差异性（准种的基因差异）都和病毒的清除无关，因此认为，在对干扰素的应答反应中，起主要作用的是宿主的抗HCV特异性的免疫反应，而不是病毒因素。有关HCV准种与干扰素应答之间的关系，尚有待进一步研究。

　　三、 小结

　　由于干扰素、利巴韦林抗HCV机制的复杂性，HCV对抗病毒治疗产生抗药性的机理尚未完全明了。目前认为，抗病毒治疗失败的原因是多方面的，涉及宿主因素、治疗因素及病毒因素，其中，HCV基因型、HCV RNA水平、联合治疗、ISDR和抗病毒治疗的疗效有密切的关系。HCV准种可逃逸α-干扰素治疗，其原因主要是HCV准种逃逸α-干扰素诱导的宿主反应，而不是逃逸α-干扰素本身。

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　　复旦大学附属华山医院 张继明 尹有宽 综述 翁心华 审校

医学空间

2004.03.09