内毒素经门静脉注射在肝脏细胞内的时相性分布

　　利用单克隆抗内毒素抗体及共焦点激光细胞内毒素半定量方法，对门静脉内注入内毒素在有肝脏多种细胞内的时相性分布进行了观察。材料和方法取Wistar雄性大鼠8只，戊巴比妥钠50mg/kg体重腹腔麻醉状态下开腹，按无菌操作游离出门静脉主干，注入大肠杆菌内毒素(Lipopolysaccharide from E. coli Sterotype 0111:B4,Sigma Chemical Co. 10mg/100g体重溶于灭菌生理盐水中）。注射后0,2, 5, 10, 30, 60分钟取肝组织，甲醛固定石蜡切片。肝组织切片经二甲苯酒精脱蜡脱水后，按常规方法进行免疫荧光染色。应用单克隆抗内毒素LIpid A抗体（日本野口先生赠送）1:800倍稀释37℃1小时，异硫氰酸荧光素(FITC)标记二抗进行染色。阴性对照以平衡盐溶液代替抗内毒素一抗。染色后于二小时内在共焦点激光扫描细胞仪下观察肝脏细胞内的抗内毒素荧光分布(confocal laser scanning microscopy LSM-200, Olympus, Japan)。同一测定条件下测定肝细胞，肝窦细胞、肝内胆管上皮细胞内抗内毒素荧光强度。每片随机取5个视野，各视野测定10个细胞共50个细胞。F检验进行统计学处理。

　　内毒素分子具有亲水及亲脂双重基因，可以通过膜受体介导及直接与胞膜结合而吞噬二种机制被摄取入细胞。经由门静脉内注射内毒素后2分钟枯否细胞内即出现胞浆内抗毒素荧光强度增加，提示枯否细胞摄取内毒素的过程非常迅速，这与众多报道相符。有人证实，内毒素进入肝脏后首先由枯否细胞吞噬，然后转移入肝细胞最终经胆道排入肠道，但通过荧光追踪及免疫学方法证实进入枯否细胞内的内毒素经三天后才转移到肝细胞。我们的实验结果显示，内毒素注射后仅2分钟，肝细胞内亦出现抗内毒素荧光增强，且半小时达高峰。推理此时进入肝细胞内的内毒素很可能是直接自肝窦进入所致。因而除枯否细胞外，肝细胞亦直接参与了内毒素的肝脏降解过程。早已证实经由肝脏排入胆汁中的内毒素具有毒性，胆汁中的毒性内毒素与胆管上皮细胞的相互作用尚不清楚。实验结果显示内毒素注射后10分钟，肝内胆管上皮细胞胞浆出现有强烈抗内毒素荧光反应。因为小胆管及叶间胆管上皮细胞均出现有同样的阳性反应，故推理胆管上皮细胞内的内毒素主要来源于胆汁，说明经肝脏排入胆汁中的内毒素可以大量进入肝内胆管上皮细胞内。有资料证实内毒素灌流肝脏后，肝内胆管上皮细胞

　　亦表现出功能代谢改变，这一变化和胆汁中内毒素与胆管上皮细胞间直接作用有何关联尚有待进一步探讨。内毒素与胆管上皮细胞的相互作用亦可能参与众多肝病肝内胆管系统病变的发生机理。

陈贤明 许瑞龄 赵元昌 马学惠 韩德五