LPZQL和PZQL的研制及其抗小鼠的日本血吸虫病活性的比较

华西药学杂志 1999年第5期第14卷 研究论文

作者：余　瑜　严和　胡湘南　靳红卫　王小根^*　卓　超^*

单位：重庆医科大学药物化学与生物材料研究室，传染病寄生虫病研究所*　重庆 400016

关键词：左旋吡喹酮；吡喹酮；脂质体；日本血吸虫病

　　提要　以提取的大豆卵磷脂为膜材，采用逆相蒸发法制备了左旋吡喹酮脂质体(LPZQL)和吡喹酮脂质体(PZQL)。用AC 920红细胞分析仪和扫描电镜检测显示：LPZQL和PZQL粒径大部分为2～4 μm，主要为大单层脂质体，对LPZQ和PZQ包裹率达98%以上。用LPZQL，PZQL和PZQ对感染日本血吸虫病的小鼠进行灌胃治疗，探讨了两种脂质体对小鼠抗日本血吸虫病的活性。动物实验表明：LPZQL疗效较PZQ高4倍；PZQL疗效较PZQ高2倍。脂质体作为靶向制剂，降低了LPZQ和PZQ的治疗剂量，提高生物利用度，可望成为抗日本血吸虫病的新剂型。

PREPARATION OF LIPOSOME OF LEVO-PRAZIQUANTEL AND

　　EXPERIMENTAL THERAPY OF SCHITOSOMIASIS IN MICE

Yu Yu　Yan Shenhe　Hu Xianglan　Jin Hongwei　Wang Xiaogen^*　Zhuo Chao^*

　　(Research Laboratory of Pharmaceutical Chemistry and Biomaterials,Institute of

　　Infectious and Parasitic Diseases^*,Chongqing University of Medical Sciences　Chongqing 400016)

　　ABSTRACT　LPZQ or PZQ were encapsulated in liposomes. The diameter of LPZQL and PZQL with large unilameller vesicles were about 2-4 μm detected by AC920 red cell analyzer and scanning electron microscope. Encapsulation efficiency of liposome to LPZQ and PZQ was over 98%. The experimental therapy of Schitosomiasis japonica in mice for the comparative efficacy of LPZQL, PZQL and PZQ showed that the efficacy of LPZQL and PZQL were higher 4 and 2 times than that of PZQ,respectively. These results indicated that LPZQL and/or PZQL may be developed to a new type of anti-schitosomiasis japonica preparation.

　　Key Words　Levo-praziquantel(LPZQ)　　Praziquantel(PZQ)　　Liposome preparation　　Schitosomiasis Japonica

　　血吸虫病为世界流行性的寄生虫病之一。吡喹酮(praziquantel, pZQ)以其高效低毒的特点作为治疗血吸虫病的首选药物，已在全世界广泛应用于人畜血吸虫病的治疗^［1，2］。

　　近年，已研究了PZQ及其旋光异构体的合成、药理和临床应用，确证其左旋体是主要的抗血吸虫成分，右旋体几乎无杀虫作用^［3］，对心脏的毒性左旋体比右旋体低^［2］。左旋吡喹酮(levo-praziquantel,LPZQ)灌胃给药的药动学实验表明，其在肝脏有很强的首过效应，代谢速度快，血药浓度低，其生物利用度仅4.7%^［4］。消旋体也有类似情况。灌胃给药不能充分发挥该药的作用，改变LPZQ和PZQ药物的剂型或给药途径，望能降低给药剂量，提高生物利用度。

　　脂质体(liposome)对肝脏具有定向性，作为药物的载体研究已取得重要进展，并且不断扩大应用领域^［5］，有报道^［6］，用PZQL腹腔注射后，0.5～16 h的血药浓度和肝、脾组织内药物含量均明显较PZQ其它普通剂型的相应浓度高，半衰期显著延长。PZQL的口服急性毒性LD₅₀为3 372 mg/kg，比PZQ口服急性毒性LD₅₀的2 454 mg/kg低约1/4。因此，拟利用脂质体的特点采用灌胃给药方法，当经过肝脏时，具有保护LPZQ和PZQ少发生或不发生首过效应，而定向到达靶区，发挥其作用。现特对左旋吡喹酮脂质体(LPZQL)和吡喹酮脂质体(PZQL)进行研制和对小鼠抗日本血吸虫病的活性进行研究。

　　1　材料及仪器

　　1.1　材料与试剂

　　LPZQ［(自制，批号880801，［α］_D-149°(25℃，C＝1，氯仿)］；PZQ(上海第六制药厂)；豆磷脂(自制)；内标物(2-苯甲氧羰酰-1，2，3，6，7，11b-六氢-4H-吡嗪并［2，1-a］异喹啉-4-酮，自制)。磷酸钠缓冲溶液：137 mmol/L NaCl₂，2.6 mmol/L KCl，6.4 mmol/L NaH₂PO₄，1.4 mmol/L Na₂HPO₄，pH7.4，使用时用二次重蒸馏水稀释。

　　1.2　仪器

　　LC-6高效液相色谱仪(日本)；超声波清洗器(上海超声波仪器厂)；Diskboy kurabo FB-4000微型离心机(日本)；0.2 μm微孔薄膜；85-2型旋转蒸发仪(上海)；Kyky(Amray)-1000B扫描电镜(中国科学院科学仪器厂)；AC920红细胞分析仪(瑞典)。

　　1.3　实验动物

　　100只BALB/c小鼠(♀各半)，体重18～22 g(重庆医科大学实验动物中心)。日本血吸虫尾蚴(四川省寄生虫研究所)。

　　2　实验方法与结果

　　2.1　LPZQL、PZQL和空白脂质体的制备^［5］

　　称取LPZQ或PZQ、豆磷脂、胆固醇等膜材，有机溶媒溶解，水浴上减压蒸馏除去有机溶媒，使其成膜于瓶壁，然后加入磷酸钠缓冲溶液将膜分散，再经超声波处理，即得LPZQL或PZQL，灌封于安瓿中。同法制得空白脂质体。

　　2.2　LPZQL和PZQL的粒径分布

　　用红细胞分析仪测定显示，LPZQL和PZQL(图1)粒径大部分为2～4 μm。

图1　LPZQL和PZQL的粒径分布

　　Fig 1　The size distribution of LPZQL and PZQL

　　2.3　扫描电镜鉴别

　　用扫描电镜放大5 250倍，LPZQL和PZQL(图2)都显示相应的脂质体为球形，并以大单层脂质体为主。

图2　LPZQL和PZQL的扫描电镜图(×5250)

　　Fig 2　Pictures on scanning electron microscope of LPZQL and PZQL(×5250)

　　2.4　包封率的测定

　　2.4.1　HPLC检测条件^［7］　色谱柱ODS C₁₈(5 μm，6.0 mm×15 mm，日本)；流动相MeOH-H₂O(70∶30)；流速0.8 ml/min；柱压110 kg/cm²；柱温40℃；检测波长215 nm；检测最低限度2.5 ng。膜材保留时间2.540 min，内标物保留时间4.920 min；LPZQ和PZQ保留时间约5.400 min。

　　2.4.2　样品处理及测定　取LPZQL或PZQL 1.0 ml(含LPZQ或PZQ 5 mg)，经破坏，用氯仿提取，减压除去氯仿，再用氯仿转移至10 ml量瓶中，定容至刻度，即可测定脂质体中LPZQ或PZQ的浓度(CT)。取LPZQL或PZQL 1.0 ml(含LPZQ或PZQ 5 mg)，置微孔薄膜管中，管中嵌有0.2 μm微孔薄膜，离心(1 000 r/min×12) 3 min，将膜下溶液取出，减压除去溶剂，再用氯仿转移至10 ml量瓶中，定容至刻度，即可测定脂质体中游离LPZQ或PZQ的浓度(CF)。用HPLC测定LPZQ或PZQ的浓度(表1)。包封率(E%)计算式为：E＝(1-CF/CT)×100%。结果LPZQL和PZQL的包封率分别为98.2%和98.4%。

表1　HPLC测定CT和CF的结果

　　Table 1　Results of determination of CT and CF with HPLC

　　2.5　日本血吸虫病小鼠的治疗

　　将100只BALB/c小鼠，感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条。35 d后，按体重随机分为8组，每组9～10只，采用ig LPZQL25、50mg/kg二个剂量组；PZQL25、50 mg/kg二个剂量组；PZQ羧甲基纤维素钠100、200 mg/kg二个剂量组；相同体积的羧甲基纤维素钠组和脂质体组，二日疗法。治疗35 d后解剖小鼠，冲出门静脉-肠系膜静脉和肝内虫体，计数，并计算减虫率。LPZQL和PZQL抗小鼠的日本血吸虫病治疗效果比较见表2。

表2　LPZQL、PZQL和PZQ抗小鼠日本血吸虫病疗效比较

　　Table 2　Comparative efficacy of LPZQL、PZQL and PZQ in experimental therapy of Schitosomiasis japomica in mice

　　由表2可见，脂质体载LPZQ和PZQ抗小鼠的日本血吸虫病有效。LPZQL 50 mg/kg组减虫率高达74.5%，与LPZQL 25 mg/kg、PZQL 50 mg/kg和PZQ 100 mg/kg三个组减虫率相比，有显著的差异(P＜0.01)；与PZQ 200 mg/kg组减虫率相似，无显著的差异(P＞0.05)。LPZQL25 mg/kg、PZQL 50 mg/kg和PZQ 100 mg/kg三个组减虫率相似，无显著的差异(P＞0.05)。以上数据表明，LPZQL疗效较PZQ高4倍；PZQL疗效较PZQ高2倍。

　　3　讨论

　　3.1　LPZQ和PZQ均为脂溶性药物，在氯仿中易溶，在水中不溶。利用这一性质，采用逆相蒸发薄膜法制作的LPZQL和PZQL粒径大部分为2～4 μm，主要为大单层脂质体，对LPZQ和PZQ包裹率达98%以上。

　　3.2　脂质体是一种具有类似生物膜结构的双分子小囊，其双分子层中或双分子层间可包含药物。LPZQ和PZQ可以非共价键方式被包裹于脂质体中。利用脂质体口服给药可促进LPZQ和PZQ被胃肠吸收，并保护被包裹的LPZQ和PZQ不被降解，提高了LPZQ和PZQ的生物利用度。LPZQL和PZQL两种脂质体进入体内主要被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬，而治疗小鼠的日本血吸虫病。从减虫率指标显示，脂质体载LPZQ和PZQ治疗小鼠的日本血吸虫病有效。

　　3.3　在相同剂量下，LPZQL比PZQL抗小鼠的日本血吸虫病作用好，减虫率高20～30%。在相似疗效(减虫率)下，LPZQL较PZQ减少4倍的剂量；LPZQL较PZQL减少1倍的剂量；PZQL较PZQ减少1倍的剂量，仍有较高疗效。这与脂质体载LPZQ和PZQ，经过肝脏，具有保护LPZQ和PZQ少发生或不发生首过效应，从而定向到达靶区，发挥其最大作用，而延缓LPZQ和PZQ的释放，使LPZQ和PZQ半衰期延长有关。据文献报道^［6］，PZQ在血中的消除半衰期为4.8 h，而PZQL的消除半衰期为17.6 h，后者为前者的3.6倍。由于脂质体载药使血药浓度维持较高水平，让门静脉血管内的血吸虫持续接触有效的药物浓度，使低4倍剂量的LPZQL也能达到高剂量PZQ的相似疗效，从而提高了LPZQ和PZQ的生物利用度，为LPZQL和PZQL脂质体作为新剂型应用于临床提供了理论依据。希望LPZQL和PZQL脂质体能成为抗日本血吸虫病的新剂型。

　　参考文献

　　1　　Andrews P, Thomas H, Pohlke R, et al. Praziquantel. Med Res Rev, 1983,3(2)∶147

　　2　　余瑜，严和.抗血吸虫药物吡喹酮的研究进展.重庆医科大学学报，1990，15(1)∶82

　　3　　Liu YH, Qian MX, Wang XG, et al. Comparative efficacy of praziquantel and its optic isomers in experimental therapy of schistosomiasis japonica in rabbits. Chinese Med J, 1986,99(12)∶935

　　4　　钱明心，刘约翰，王小根等.左旋吡喹酮在体内的药物动力学.中国药理学通讯，1988，5∶62

　　5　　Szoka F, Olson F, Heath T, et al. Preparation of unilameller liposomes size (0.1～0.2m) by a combination of reverse phase evaporation and extrusion through polycarbonate membranes. Biochim Biophy Acta,1980,601∶559

　　6　　李富荣，蒋次鹏，曹和洵等.吡喹酮脂质体对泡球蚴病的治疗效果探讨.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11(4)∶251

　　7　　钱明心，刘约翰，王小根等.测定左旋吡喹酮血药浓度的反相高效液相色谱法.重庆医科大学学报，1988，13(1)∶67