我国四株狂犬病毒糖蛋白基因序列分析和位点比较

中国病毒学 2000年第1期第15卷 研究报告

作者：唐青　Lillian A Orciari　Charles E. Rupprechti　赵秀芹　李志刚　杨为松

单位：唐青 赵秀芹(北京中国预防医学科学院流行病研究所，北京　102206)；Lillian A Orciari(美国疾病控制中心，美国)；Charles E. Rupprechti(美国疾病控制中心，美国)；杨为松(第四军医大学唐都医院传染科，西安　710038)；李志刚(宁夏自治区卫生防疫站，银川　750004)

关键词：狂犬病毒；糖蛋白；基因；同源性；致病性；嗜神经性

　　摘　要：测定我国人用狂犬疫苗株(aG)、减毒株(CTN-181)及两株街毒 糖蛋白(GP)基因cDNA的核苷酸序列及推导氨基酸序列。结果两株街毒仅相差两个碱基和一个氨基酸残基；两株街毒与CTN的同源性(85.9%)高于aG株(81.9%)；聚类分析将街毒和固定毒分为两支。比较GP嗜神经位点的氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位高度同源。被认为决定毒力的333位Arg，CTN发生了Q替换，其它毒株均为Arg333。所比较的毒株均存在319位糖基化位点，此外37位糖基化位点也相对保守；GP两个主要抗原表位，GⅡ的氨基酸构成完全一致，GⅢ只在一些减毒株中发生与毒力密切相关碱基的替换。

　　分类号：R373.9　文献识别码：A

　　文章编号：1003-5125(2000)01-0022-12

Sequencing and Position Analysis of the Glycoprotein Gene

　　of Four Chinese Rabies Viruses

TANG Qing, YANG Wei-song

　　(Epidemiology and Microbiology Institute of National Academy

　　of Preventive Medicine, Beijing 102206, China)

　　Lillian A Orciari

　　(National Center for Infectious Diseases Control, 1600 Clifton Road,

　　N.E. Atlanta, Georgia 30333, USA)

　　Abstract：The glycoprotein gene of human rabies vaccine strain (aG), one attenuated fixed strain (CTN-181) and two street viruses were sequenced and the amino acid sequences were deduced. The result shows that two street strains have two differences in nucleotide sequences and one in amino acid sequences, the nucleotide homology was higher compared with CTN (85.9%) than with aG (81.9 %). Phylogenetic tree divided the street strains and the laboratory strains into two branches. High amino acid sequence similarity was present between the segments of the viral GP which may function as a recognition site for AchR and the receptor-binding region of the neurotoxins; CTN strain had Q substitution at position 333 and the other virulent strains preserved 333 Arg. In all strains 319 glycosyl ation was existed, glycosylation on 37 is also relatively conserved. The amino acid constitution of antigenic site Ⅱ is identical in all compared strains, but on site Ⅲ some attenuated strains have amino acid substitution on position 333 and other sites which related with pathogenicity.

　　Key words：Rabies virus; Glycoprotein; Gene; Homology; Pathogenicity; Neurotropic▲

　　狂犬病毒糖蛋白(GP)是嵌在病毒粒子表面形成棘状突起的结构成分，它既可以诱导宿主免疫反应产生中和抗体和刺激细胞免疫，又作为媒介使病毒吸附在宿主细胞表面进而侵入细胞，因此无论是在病毒的免疫原性或病毒的组织嗜性和毒力方面，GP都起着决定性作用。目前一些实验室固定毒株的GP基因序列测定已相继完成^［1，2］。我国到目前为止仅进行过广西一只疯犬分离毒株和中国人用疫苗株(3aG和5aG)的GP基因序列测定^［3，4］。通过对这些毒株的序列测定和分析已知狂犬病毒GP基因由1650个核苷酸残基组成，完整阅读框(ORF)从起始密码(ATG)到终止密码(TGA)共1575个核苷酸残基，编码524个氨基酸。流行于不同地区、不同宿主的狂犬病毒，其GP基因的变异远远大于核蛋白基因。由于GP与狂犬病的预防和致病密切相关，我国狂犬病流行严重，宿主动物种类又多，对本国分离毒株GP基因的分析和研究，有助于深入了解我国狂犬病毒致病和保护性免疫的机理，为此在对我国四株狂犬病毒GP基因序列测定的基础上进行了有关GP基因与致病性、免疫原性及组织嗜性关系的分析和研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　病毒　aG为中国人用地鼠肾细胞疫苗株，因分离自北京也称北京株(PG)，由中国预防医科院流研所严玉辰老师提供。CTN-181为实验室减毒株，由中国药品生物制品检定所严子林老师提供。CNX8511和CNX8601是我国宁夏省卫生防疫站收集的两例临床诊断为狂犬病的死亡病人脑组织标本，两份标本冻存于-20℃经多年后送至流研所经乳鼠脑传代，冷冻切片后用抗狂犬病毒荧光抗体染色鉴定为狂犬病毒并分离得到病毒，均为街毒。

　　1.2　PCR及序列反应引物　用于RT-PCR和序列反应的寡核苷酸引物，通过比较已发表的ERA株、中国广西毒株及中国人用疫苗株的序列设计合成P1-P4引物，引物941、763、93G、1444、1323、1171、989、754由美国CDC提供；采用分段PCR和分段测序的方法对4株中国狂犬病毒进行GP基因全序列测定：

　　1.3　RT-PCR　用RNA分离试剂TRI_ZOL分离病毒RNA(按试剂说明书操作)，用正向引物逆转录合成cDNA第一链，PCR扩增cDNA，参数如下：94℃30s50℃30s，72℃1min30s，共循环40次。PCR产物经低熔点胶电泳及Wizard^TMPCR Preps DNA Purification System试剂盒纯化。

　　1.4　双脱氧链末端终止法直接进行cDNA的核苷酸序列测定　测定引物用与PCR反应相同的引物，PCR扩增并纯化后的产物为模板，每个PCR产物分别用正向和反向两个引物从两个方向进行单链测序反应，序列测定用PRISM^TMReady Reaction DyeDeo-xy^TM Terminator Cycle Sequencin g Kit进行。 在总容量为20μL的测序反应中含有：9.5μL Prizm Tag Dydeoxy Terminator (包括四 种末端标记有不同波长荧光物质的双脱氧核苷：1.58μmol/L a-DyeDeoxy, 94.74μmo l/L T-DyeDeoxy, 0.42μmol/L G-DyeDeoxy, 47.37μmol/L C-DyeDeoxy; 15.79 μmol/L dNTP和0.42u/μL Tag DNA聚合酶)；2μL 1.6pmol/L引物；纯化并干燥后的 PCR产物(cDNA)约1.0μg溶在7μL H₂O中作为模板；补充H₂O至20μL，混均后在PCR仪上进行测序反应，反应条件：96℃30s,50℃15s,60℃4min，共循环25个周期。四种带标记的双脱氧核苷链末端终止反应均在一个反应管中进行，用373ADNA自动测序仪经10～12h电泳后直接读取核苷酸序列。

　　1.5　计算机分析　将序列结果输入计算机，用Winstar软件在计算机上进行分析和比较。

　　2　结果

　　2.1　四株狂犬病毒GP基因编码区核苷酸序列和推导氨基酸的序列及其比较

　　计算机分析四株病毒GP基因ORF，四株病毒GP基因编码区均从起始密码ATG开始，终止密码除CTN株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基，四株病毒GP基因核苷酸序列见图1。两株街毒核苷酸序列仅在960和1535两位点相差两个碱基，与CTN及aG株相比两株街毒与CTN的同源性(85.9%)大于aG株(81.9%)。根据已发表的资料^［5］，狂犬病毒GP基因可分为四个区，即：信号肽编码区(1～57位核苷酸)、膜外区(58～1374位核苷酸)、穿膜区(1375～1440位核苷酸)和膜内区(1441～1575位核苷酸)。比较四株病毒GP基因不同区段核苷酸及氨基酸序列(见表1)，膜外区同源性高于其它三个区，最低的是膜内区，氨基酸序列同源性样均大于相应区段的核苷酸序列。

表1　G基因不同区段核苷酸和推导氨基酸序列同源性比较

　　Table 1 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t segments of GP genes

图1　四株狂犬病毒GP基因核苷酸序列

　　Fig.1 Sequence of nucleotides of four rabies viruses GP genes

　　2.2　与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性比较

　　将本次测定的四株病毒GP基因编码区序列与广西毒株CGX89-1及国外一些毒株GP基因编码区 序列进行比较，同源性从50.9%到99.9%(见表2)，平均83.7%，同源性最低的是在CV S和Mokola两个毒株之间，为50.9%。明显可以看到的是Mokola株几乎和所有与其比较的毒株 同源性均很低，从50.9%(Mokola/CVS)到51.9%(Mokola/CNX8511和CNX8601)。如果不包括Mok ola株，同源性平均为87.3%。从表2还可以看到来自中国同一地区的两株街毒(CNX8511/ CNX8601：99.9%)之间和来源于同一毒株的两株兽用减毒疫苗株之间(SAD-B19/ERA：99.4%) 均表现GP基因序列高度同源。

表2　不同狂犬病毒G基因核苷酸和氨基酸序列同源性比 较

　　Table 2 Comparison of nucleotides and deduced amino acid homologies of differen t rabies viruses GP genes

　　注：核苷酸序列同源性(上方)和氨基酸序列同源性(下方)

　　Note. The percentages of nucleotides (top) and amino acid (bottom) similarity.2.3　聚类分析

　　通过计算机Clustal Method对四株检测病毒与已经发表的国内外毒株的GP基因进行聚类分析 ，绘出系统发生树状图(见图2)。从图2可以看到所有血清(基因)一型毒株形成一个分支，在 这一个分支下，中国宁夏人分离的两株毒株、广西犬毒株和CTN归于一类；其它毒株归于另 一类，即10种病毒归为两大类：实验室固定毒和街毒，这些街毒均来自于中国。CTN虽然并 非新分离的街毒，但与其它实验室固定毒相比，分离时间短，动物和细胞传代次数也少于其 它实验室固定毒，因此与中国其它街毒更接近。相比之下，其它实验室固定毒株已分离至少 50年以上，经过多种动物和细胞传代并作为疫苗株，在生物学特性上有着更多的相似性，因 此表现为相互之间有着更近的亲缘关系。Mokola是血清(基因)三型毒株，形成一个完全独立 的分支。

图2　不同狂犬病毒GP基因系统发生 树状图

　　Fig.2 Phylogenetic tree of different rabies virus's GP genes

　　2.4　GP膜外区部分抗原位点氨基酸构成的比较和分析

　　2.4.1　与抗原特性和毒力有关区段的比较　狂犬病毒与中和抗体结合的主要部位是GP分子 上第三(GⅢ)和第二抗原部位(GⅡ)^［6］。GⅢ大约位于第330～357位氨基酸区段，其中333位氨基酸Arg (R，精氨酸)被认为是狂犬病毒嗜神经性和毒力的关键残基，如果该部 位R被Q(谷氨酰胺)、Ⅰ(亮氨酸)或G(甘氨酸)取代，病毒的毒力将会大大降低^［7］ 。GⅡ大约位于34～200位氨基酸区段^［8］，至少含两个主要表位：34～42和198～2 00区段。GP抗原性变化经常是因为GⅡ位点上34～42位和198～200位氨基酸以及GⅢ位点上33 0～340位氨基酸的改变造成。比较不同狂犬病毒GP氨基酸序列在这些区域的构成，结果见表3。

表3　不同狂犬病毒GP基因GⅢ和GⅡ区氨基酸序列比较

　　Table 3 Amino acid sequence comparison of GⅢ and GⅡ of different rabies virus es GP genes

　　CTN、SAD-B19和HEP是减毒株，Flurry和ERA株为兽用疫苗株，这些毒株在GⅢ区氨基酸 序列与其它毒株相比有所不同。其中CTN和HEP株333位的R被Q(Glu)替代，Flurry株则被G(Gl y)替代。这三株毒株都是减毒株，都在333位发生了Q或G的替换，这与以往的研究结果 ^［7］一致。SAD和ERA株在339位的I(Ile)被L(Leu)替代。SAD也是减毒株，ERA为兽用口 服活毒疫苗株，其毒力也较普通疫苗株低，因此推测339位的碱基是否也与毒力有关。其余 毒株中8511、8601和CGX是街毒、aG和PV株是用于生产灭活疫苗的毒株、CVS是世界标准攻击 毒 株，这些毒株均保留了毒力，在GⅢ区氨基酸序列也完全相同。以上所有毒株在GⅡ区两个表 位的结构均相同。

　　2.4.2　与组织嗜性有关区段的比较　目前认为狂犬病毒在体内的细胞受体是乙酰胆碱受体( acetylcholine receptor, AchR)，因为狂犬病毒GP与AchR的一种高亲和配体——箭毒样蛇 神 经毒素有明显的结构相似性，尤其是GP第189～214位氨基酸与该毒素第二长毒性环第30～56 位的氨基酸序列^［9］高度同源(50%)，这一区段正是神经毒素与AchR的结合部位， 其中Arg37是所有神经毒素中绝对保守的基团，也是神经毒素与AchR结合的重要位点。为了 证实这一推论，我们对神经毒素与AchR结合部位的氨基酸序列和狂犬病毒GP相应位置的氨基 酸序列进行了比较，结果除Mokola株外同源性达50%(见表4)。国内鹿分离的一株病毒GP膜外 区部分片段的序列测定也显示此位点的高度同源^［10］。被认为是结合区域中保守 位点的Asp31、Phe33、Gly38、Lys39残基，GP也与神经毒素的完全相同。即使是序列相差较 远的Mokola株，该段序列也表现较高的同源性。

表4　狂犬病毒嗜神经区段和位点的比较

　　Table 4 Site and segment comparison of neuron tropism of rabies viruses

　　2.4.3　与糖基化位点有关区段的比较　狂犬病毒GP细胞外区域有糖基化位点，适当的糖基 化对GP的表达非常重要。目前的研究已经证实可溶性糖蛋白(Gs)只在319位有一个糖基化位 点Asn(天冬酰胺)，GP则有数个糖基化位点。不同的狂犬病毒糖基化位点的数目和位置不完 全相同^［11］，但大多数有三个，其结构特点是N-X-S(Asn-X-Ser) 或N-X-T(Asn-X-Thr)，其中319位糖基化位点存在迄今已测序的所有狂犬病毒中 ^［12］。本研究中四株病毒GP的糖基化位点不完全相同，与其它毒株相比也有差异 ，但319位糖基化位点(N-K-T)存在于四株病毒以及所有进行比较的毒株中，只是Mokola株 在此糖基化位点的氨基酸构成上与其它毒株不完全相同(N-G-S)。此外，37位糖基化位点 存在除Mokola株外所有进行比较的毒株中。158位(CGX、PV、SAD和Flurry)和247位(CTN、aG 、PV、SAD和ERA)糖基化位点也相对比较集中。唯有与其它毒株差异较大的Mokola株在202位 有一个糖基化位点。3　讨论

　　3.1　病毒株与核苷酸序列同源性的关系

　　在已经测序的中国病毒中，8511和8601来自1985和1986年死亡的病人，CGX于1989年从广西 一只疯犬分离，CTN1983年分离自济南一只疯犬。四株病毒分离年代接近，8511、8601和CGX 都是街毒。单克隆抗体分析表明8511和8601是犬毒株，CGX和CTN原本分离自犬，因此这四株病毒的宿主动物是一致的。aG株是1935年从北京一只狂犬分离的，至今已经历了60多年的实验室动物和细胞传代，成为人用疫苗株，其生物学性状已经发生了很大变化。因此无论是核苷酸序列或氨基酸序列，三株街毒与CTN的同源性(核苷酸：85.9%～99.9%，氨基酸：92.4%～99.8%)高于同aG株(核苷酸：81.9%～82.7%；氨基酸：88.2%～90.5%)相比。将我国病毒GP序列与国外血清Ⅰ型一些固定毒株进行比较，氨基酸序列同源性均高于核苷酸序列同源性。CVS源于法国狂犬病牛的病毒，目前作为具有较强毒力的国际标准攻击毒株，CTN与CVS无论从宿主来源还是后来的传代过程都不相同，两者在毒力及实际应用上也有很大差异，因此基因结构相距较远也不奇怪。ERA和SAD-B19都是兽用疫苗株，其中SAD-B19是减毒株，但两个毒株来源一致，所以具有很高的同源性。另外还可以看到的是疫苗株之间同源性高，即使是在中国和欧美疫苗株之间也表现较高的同源性：核苷酸序列同源性为88.9%(aG/Flury)～99.4%(ERA/SAD-B19)。能够筛选作为疫苗株的毒株在产生保护性免疫的作用上应有共同之处，因此疫苗株可能会在抗原结构上有更多的相同之处，基因结构也较接近。将所有这些毒株与血清型不同的Mokola株(血清型Ⅲ)相比，则核苷酸(50.9%～51.9%)和氨基酸(55.3%～56.2%)序列都有很大差异，从中不难理解血清Ⅰ型的疫苗株对血清Ⅲ型的Mokola株基本没有保护作用的原因。由此可以看到生物学性状相近的毒株，基因结构也相近。

　　3.2　GP结构与保护性免疫的关系

　　电镜研究已经证实在病毒表面的狂犬病毒GP以一种三聚体形式存在。许多具有受体识别和膜融合特性的病毒，其外膜蛋白也都以同样形式存在，这可能在生物学上有其重要性，也可能反应与受体识别和膜融合特性有关机制的相似性。虽然随着时间的推移，描述狂犬病毒GP抗原位点的数目有所增加，但能够解释得比较明确的只有抗原位点GⅠ、GⅡ和GⅢ。GⅠ是只含有一个表位的独立位点。GⅡ是一不连续的构象依赖性抗原区，位于34～200区段，其中主要两个表位在34～42和198～200区段；GⅢ大致位于330～357区段，其中与抗原性关系最大的为第333、336、339和357位残基。虽然GⅢ由更为连续的表位组成，但与GⅢ结合的单抗不能识别其非折叠状态，表明这些氨基酸在蛋白表面有一定的立体结构。此外264位R(Arginine)被H(Histidine)取代和44位M(Methionine)被Ⅰ(Isoleucine)取代也可以使GP抗原性有所改变。从我们测序推导的氨基酸序列来看，四株病毒中两株固定毒(CTN和aG)264位是H而两株街毒(8511和8601)264位是R。减毒株CTN同时还有与毒力密切相关的333位R(Arginine)和336位N(Asparagine)被Q(Glutamine)和D(Asparticacid)所替代(见表3)。比较国际毒株，Flury和HEP也在333位发生了G(Glycine)和Q替换。三株减毒株都在333位发生了氨基酸残基的替换，而街毒以及其它保留了原有毒力的固定毒株在此位点仍为R残基，由此看来333Arg是决定狂犬病毒毒力的一个主要位点。另外，在认为与抗原性关系较大的339位，ERA和SAD株由L(Leucine)替代了Ⅰ。这两个毒株均为兽用活毒苗株，并且SAD是减毒株，因此339位可能也与病毒的毒力有关。在GⅡ区氨基酸序列，所有比较的毒株全部一致，说明GⅡ比GⅢ区保守。

　　3.3　GP结构与组织嗜性的关系

　　狂犬病毒的增殖基本限于神经细胞内。由于GP189～214位氨基酸序列与蛇神经毒素同AChR结合部位的序列高度同源，抗MAb-G独特型抗体也能与一些脑组织结构结合，因此曾推测GP有烟酸型乙酰胆碱受体(nAChR)作为狂犬病毒的受体。但仍然不清楚的是这种相互作用是否能引起病毒入侵。Christine等^［13］用重组杆状病毒在昆虫细胞表面表达CVS株GP(Gcvs-Sf2)来研究GP与神经细胞之间的结合，发现几种有不同神经介质的哺乳动物神经细胞均可使狂犬病毒侵入，胆碱能和肾上腺素能神经瘤细胞都有Gcvs-Sf2结合位点的表达，提示在神经介质分泌和狂犬病毒特异性结合位点的表达之间没有关系。此外，狂犬病毒还可以感染没有nAChR的神经原，因此可能还有别的分子作为狂犬病毒的受体。研究还发现GP330或333位的单个突变既不能破坏Gcvs-Sf2与神经细胞的结合，也不能影响肌肉接种狂犬病毒后感觉和运动神经原的感染。但330和333两个位点变化后都会大大降低Gcvs-Sf2对神经细胞的亲和能力，也失去感染感觉和运动神经原的能力。体外实验狂犬病毒CVS株和CVS无毒变异株均可感染神经瘤细胞。Hanham等^［14］推测狂犬病毒有两种类型的受体：高亲和力受体，只存在于神经细胞表面造成动物神经原的感染；低亲和力受体，存在于各种神经或非神经细胞表面。这种普遍存在的低亲和力受体在细胞表面高密度存在，并且可以包括BHK细胞表面饱和状态的结合位点。除此之外，磷脂^［15］、糖脂和神经节苷脂^［16］及蛋白也是狂犬病毒的受体，所以神经原表面的高亲和力受体的特性有待进一步阐明。但狂犬病毒GP第189～214位氨基酸与α-环蛇毒素同nAChR结合部位的氨基酸序列高度同源在本研究中也得到了证实(见表4)，尤其值得提出的是核苷酸和氨基酸序列同源性与血清Ⅰ型毒株相比都很低的Mokola株，在嗜神经位点上也表现有一定的同源性。可见nAChR学说可以解释狂犬病毒嗜神经特性的大部分特点，但它不是狂犬病毒与靶细胞表面作用的唯一方式。

　　3.4　街毒和固定毒GP的变异