狂犬病毒单抗重链可变区基因的克隆及在原核细胞中的表达

中华实验和临床病毒学杂志 2000年第1期第14卷 简报

作者：徐丽宏　陶三菊　陈伯权

单位：徐丽宏（100052　北京,中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒室）；陶三菊（100052　北京,中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒室）；陈伯权（100052　北京,中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒室）

　　狂犬病是一种烈性传染病，一旦被带狂犬病毒的动物咬伤或抓伤，常规处理是注射狂犬病毒灭活疫苗，但抗体产生较慢，对严重咬伤者影响治疗效果，主张在注射疫苗的同时注射抗狂犬病毒的免疫血清或单克隆抗体。但目前所能获得的上述制剂均来自动物，进入人体后易引起过敏反应^［1，2］，而人的免疫血清及单克隆抗体又相当难获得。因此近年来分子生物学的发展使基因工程抗体得以产生并取得了令人瞩目的成就。自1989年Ward等^［3］成功地克隆并表达了抗裂解酶单抗VH单域抗体后，国内外相继报道了许多这方面成功的例子。我们利用基因工程技术表达的VH单域抗体，是既能中和RV又不含引起人抗鼠免疫反应的抗体。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料来源　RV及分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F6均由中国预防医学科学院病毒学研究所虫媒研究室提供，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中国军事医学科学院。抑制型菌株JM109购自美国Promega公司；质粒pUC 18购自华美公司；噬菌粒载体pHEN 1由虫媒室提供；辅助噬菌体M13K07购自Promega公司。限制性核酸内切酶、Klenow酶、T4 DNA连接酶均购自Promega公司。

　　1.2　DNA提取　按常规方法进行。

　　1.3　引物的设计与合成^［4］　根据鼠源单抗重链可变区(VH)基因框架结构(FR)碱基序列的保守性，设计了一对分别针对FR1与FR4的引物序列，5′端序列为：5′-GGGTCGACCAGGTCCAACTGCAG(C/G)AGCT(T/A)GG-3′，3′端引物序列为：5′-GGGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGA(C/G)TG(A/T)GGT(C/G)C-3′。

　　1.4　PCR扩增目的基因片段　以基因组DNA为模板，利用上述一对引物进行PCR扩增，参数如下：94℃45 s，59℃45 s，72℃90 s，共35个循环，再以PCR产物为模板，同样条件进行又一轮PCR共35个循环。

　　1.5　PCR产物的克隆及序列分析　PCR产物按常规方法经低融点琼脂糖纯化回收后，Klenow酶补平，克隆入线性化质粒载体pUC18(SalⅠ酶切并用Klenow酶补平)中。经蓝、白斑筛选及单双酶切分析，阳性克隆采用双脱氧链末端终止法进行了序列分析，具体操作按Promega自动测序试剂盒说明书进行。

　　1.6　重组噬菌粒的构建及筛选　将重组质粒pUC 18及噬菌粒pHEN1分别用Not Ⅰ和SalⅠ双酶切，低融点琼脂糖纯化回收目的基因片段及线性化载体DNA，T4 DNA连接酶连接并转化感受态宿主菌JM109。按常规方法提取质粒DNA，经单、双酶切筛选，重组噬菌粒命名为pH6，并将含pH6的菌种用50%的甘油保存于-70℃。

　　1.7　VH基因的诱导表达　具体操作参照文献［5］并加以改进：取30 μl含pH6的菌种，接种于3 ml 2YT-AMP-GLU培养基中，37℃振荡10 h后，取30 μl加入另外3 ml预热至37℃的2 YT-AMP-GLU培养基中，同时加入10　μlM13K07，37℃孵育1 h，4 000 r/min离心10 min，沉淀重悬于3 ml 2YT(AMP 100　μg/ml,Kana 25 μg/ml)中37℃振荡过夜，4 000 r/min离心10 min，去除细菌沉淀，上清直接用于检测。

　　1.8　表达产物的初步检测

　　1.8.1　阻断ELISA法　除第二步分别加入含有表达产物的细菌上清及M13K07外，余皆按常规ELISA法进行。然后将含pH6的细菌上清及M13K07分别连续2倍稀释，重复阻断ELISA实验。阻断率计算公式：阻断率(%)=［1-(待测标本A值-空白孔A值)/(阴性对照孔A值-空白孔A值)］×100%

　　1.8.2　重组噬菌粒与RV抗原共沉淀实验　按参考文献［6］，含pH6的1ml上清中加入10 μl RV灭活抗原，4℃孵育18 h后，3 000 r/min离心10 min，观察沉淀，同时以M13K07作阴性对照。沉淀用PBS洗过后分别重悬于0.5 ml LB液体培养基，再与0.5 ml过夜培养的新鲜带菌毛的JM109混合，37℃孵育1 h，分成小份涂在1.5%的LB琼脂平板上(AMP 100 μg/ml)，37℃培养过夜，观察菌落生长情况。阳性组随机挑选3个白色菌落，重复诱导表达，并用阻断ELISA法进行检测。

　　2　结果

　　2.1　VH基因扩增　通过两轮PCR扩增，产物在2%的琼脂糖凝胶中有一大小约为360 bp的强荧光带(图1)。

1，3：VH基因的PCR扩增产物；

　　2：pBR322/Hinf Ⅰ

1　PCR扩增VH片段的结果

　　Fig.1　Fragment amplified by PCR 1,3:PCR product of VH gene.2:pBR322/Hinf Ⅰ

　　2.2　重组质粒pUC18的筛选及序列分析　将VH基因与线性化质粒载体pUC18连接并转化JM109后，经蓝、白斑筛选，质粒DNA的酶切图谱分析结果见图2。通过用pUC/M13正反向通用测序引物对该重组质粒DNA进行序列测定(图3)，证实所插入片段确为鼠抗体的重链可变区基因，且为反向插入，2F6 VH基因全长363 bp，共编码121个氨基酸。

1：λDNA/HindⅢ；2：质粒pUC18DNA/Eco RⅠ;3:重组质粒pUC18的DNA/Eco RⅠ;4:重组质粒的DNA/SalⅠ+NotⅠ;5:pBR322/HinfⅠ

2　重组质粒pUC18的酶切图谱分析结果

　　Fig.2　Identification of recombinant plasmid pUC18 by using restriction enzyme digestion

　　1:λDNA/HindⅢ. 2:Plasmid pUC18DNA with EcoRI digestion.3:Recombinant plasmid DNA with EcoR Ⅰdigestion.4:Recombinant plasmid DNA with Sal Ⅰ and Not Ⅰ digestion.5:pBR322/Hinf Ⅰ

图3　VH基因的序列及其所编码的氨基酸

　　Fig.3　Nucleotide sequence and translated amino acids of the VH gene

　　2.3　重组噬菌粒的酶切图谱分析　所构建的噬菌粒载体DNA转化感受态宿主菌JM109后，随机挑选10个白色菌落，提取DNA，经EcoR Ⅰ单酶切筛选，SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，重组噬菌粒pH6 DNA中确有一相当于PCR产物大小的片段插入。

　　2.4　阻断ELISA法对表达产物的初步检测　重组噬菌粒pH6经辅助噬菌体M13K07诱导表达后，上清直接用于阻断ELISA检测，结果见图4和图5。该重组噬菌粒具有一定的阻断作用，阻断率为41%，且具有可重复性；将该重组噬菌粒pH6及M13K07连续2倍稀释，重复阻断ELISA实验，从图5中可以看出，随着稀释度升高，阻断率不断下降，说明pH6确实带有能与RV抗原发生特异性反应的抗体片段。

图4　阻断ELISA的重复实验结果

　　Fig.4　Result of the blocked ELISA tests

图5　重组噬菌粒pH6的阻断ELISA稀释实验

　　Fig.5　Result of blocked ELISA test of pH6 by two-fold dilution

　　2.5　重组噬菌粒pH6与RV抗原共沉淀实验　RV抗原与重组噬菌粒pH6 4℃共孵育18 h后，离心可见明显沉淀，而M13K07组则没有，将沉淀重悬，感染带性菌毛的宿主菌JM109，阳性组可见均匀生长的白色菌落，M13K07组没有菌落生长。随机挑选的三个菌落表达产物的阻断ELISA实验结果与第1次相似，阻断率分别为40%，41.6%，42.4%。

　　3　讨论

　　我们的实验与目前常用的从RNA入手反转录成cDNA再进行PCR不同，而是直接从杂交瘤细胞株2F6中提取的基因组DNA中扩增出VH基因，这是因为后者更易于操作，所需费用也较低廉，而且根据抗体基因重排理论，抗体重链可变区基因外显子由V、D、J三个分离的部分组成，抗体要经过D-J连接和V-DJ连接两次DNA重组过程，才能形成一个连续的可变区外显子，这种重组在DNA水平上就已经完成了。因此，自1989年Ward等成功地从用裂解酶等免疫的小鼠脾细胞基因组DNA中克隆并在大肠埃希菌中表达了特异性VH基因后，国内也相继报道了直接从杂交瘤细胞DNA中扩增出并表达抗体的轻、重链基因^［7，8］。然而由于重排的抗体V区功能性基因属于单拷贝基因，第一轮PCR扩增后，目的基因片段很少，以此为模板，再行PCR扩增，得到了特异性较好的目的基因片段。我们利用了噬菌粒表达系统，经阻断ELISA实验初步检测，得到了能与RV发生特异结合的VH单域抗体，并将该单域抗体与噬菌体外膜蛋白Ⅲ以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，免疫共沉淀实验进一步证实了该重组噬菌粒确实带有了功能性抗体片段而又没有影响其感染性，为下一步制备游离抗体奠定了基础。

　　从本实验中我们也可以看出，该VH单域抗体结合抗原的作用较弱，这是因为缺乏VL的相互作用造成的，Ward等^［3］也曾报道，VH单域抗体与相应抗原的亲和力比亲本抗体要弱大约10倍，因此这离实际应用还差得较远，我们的最终目的是利用本实验所建立的噬菌粒表达系统来制备游离的VH-VL单链抗体或Fab片段，为狂犬病防治研究提供更切实可行的方法，下一步实验正在进行中。

　　参考文献

　　1，Larrick JW.Potential of monoclonal antibodies as pharmacological agents.Pharm Rev,1990,41:539-557.

　　2，Larrick JW,Bourla JM.Prospects for the therapeutic use of monoclonal antibodies.J Biol Resp Mod,1986,5:379-387.

　　3，Ward ES,Gussow D,Griffiths AD,et al.Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from E.Coli .Nature,1989,341:544-546.

　　4，Orlandi R,Gussow DH,Jones PT,et al.Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci U S A,1989,86:3833-3837.

　　5，Hoogenboom HR,Griffiths AD,Johnson KS,et al.Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains.Nucleic Acids Res,1991,19:4133-4137.

　　6，Kang AS,Barbas CF,Janda KP,et al.Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces.Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88:4363-4366.

　　7，韩骅，杨立宏，药立波，等.抗人黑色瘤单抗轻链可变区基因的克隆与序列分析.第四军医大学学报，1991，12：封三.

　　8，张劲翼，程云，汪力亚，等.抗HFRSV血凝素单抗重链可变区基因的克隆及序列分析.单克隆抗体通讯，1991，7：83.

(收稿：1999-10-10)