铝佐剂对实验狂犬病疫苗的影响

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第2期第13卷 论著

作者：林海祥　Perrin P

单位：100050　北京　中国药品生物制品检定所(林海祥)；　法国巴斯德研究院(Perrin P)

　　关键词： 狂犬病毒；疫苗；佐剂

　　【摘要】　目的　对狂犬病疫苗是否应该含有铝佐剂进行实验研究。方法　通过检测疫苗抗体、效力(ED₅₀)及建立符合狂犬病现场实际的动物模型比较含铝佐剂和不含铝佐剂疫苗防治狂犬病的效果。结果　免疫后第4天和第7天抗体滴度铝佐剂疫苗组明显低于不含铝佐剂疫苗组；在NIH效力测定中，铝佐剂疫苗组的ED₅₀为93-132 ng较疫苗组ED₅₀221 ng少用抗原量一半左右，但该效力测定法不符合狂犬病现场实际；在符合现场实际的动物模型中，铝佐剂对狂犬病疫苗没有任何促进作用。结论　在实验狂犬病中，铝佐剂不促进狂犬病疫苗防治狂犬病，而且有不利影响。

　　Influence of aluminum adjuvant to experimental rabies vaccine　LIN Haixiang, Perrin P. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biololgical Products, Beijing 100050

　　 　　【Abstract】　Objective　To study whether the rabies vaccine for human use should contain aluminum adjuvant.Methods　Testing vaccine antibodies and efficacy(ED₅₀), comparing the effect between aluminum adjuvant contained and non-aluminum adjuvant contained vaccines in a new animal model which accords with the rabies field practice.Results　At fourth and seventh day after immunization, the neutralizing antibody titres of the rabies vaccine containing aluminium adjuvant were much lower than that of the vaccine not containing aluminum adjuvant. In the NIH efficacy test the ED₅₀ of the vaccine containing aluminum adjuvant was 93-132 ng while the ED₅₀ of the vaccine not containing aluminum adjuvant was 221 ng, but the NIH test does not accord with the rabies field practice. In that new animal model, aluminum adjuvant to rabies vaccine had not any promoting effect for preventing and treating rabies.Conclusion　Aluminum adjuvant to rabies vaccine has no advantages, this paper suggests that the vaccines containing and not-containing aluminium adjuvant had better compare in human bodies. If the results are the same as our experiments, the aluminum adjuvant should be eliminated from rabies vaccine for human use.

　　 　　【Key words】　Rabies virus　　Vaccine　　Adjuvant

　　自1926年Glenny等发现铝沉淀的白喉类毒素悬液，较不含铝的白喉类毒素具有高得多的抗原性以来，铝佐剂仍然是迄今唯一批准的人用佐剂。铝佐剂包括Al(OH)₃、AlPO₄和Al₂O₃。目前中国普遍使用的是原代地鼠肾细胞氢氧化铝狂犬病灭活疫苗^［1］，国外高质量的狂犬病疫苗包括HDCV(人二倍体细胞疫苗)、PVPV(纯化Vero细胞疫苗)、PCECV(纯化鸡胚细胞疫苗)、PDEV(纯化鸭胚细胞疫苗)等均不含铝佐剂。对于在人用狂犬病疫苗中是否应该加入铝佐剂问题，我们在法国巴斯德研究院进行了实验研究。

　　1　材料和方法

　　1.1　小鼠　OF₁小白鼠：4周龄，巴斯德研究院提供。

　　1.2　细胞株　BHK₂₁C₁₃株^［2］：巴斯德研究院狂犬病室提供。

　　1.3　病毒株　巴黎PV株^［3］：法国巴斯德研究院的狂犬病毒株，在BHK₂₁细胞中繁殖收获后，用β-丙内脂灭活和密度梯度离心，生产出实验用IPRV，即灭活提纯的狂犬病疫苗。CVS：国际通用的标准狂犬病毒攻击毒株，在BHK₂₁细胞上繁殖，经低速离心上清液获得。

　　1.4　WRVS 9 147(RD 9 147)株　从疯狐狸中分离的狂犬病野毒株，在成神经瘤细胞中传代，根据其核蛋白基因的核苷酸顺序与原分离时相同,而表明WRVS

　　株的性质并没有因在细胞中传代而改变。CVS和WRVS的滴度通过测定小白鼠脑内LD₅₀表达。

　　1.5　小白鼠的感染和治疗　取4周龄小白鼠，于腹股沟皮下感染WRVS病毒，然后在6～12小时、3、7天等用IPRV或铝佐剂IPRV在感染部位注射治疗，观察死亡率。

　　1.6　ED₅₀测定　按WHO推荐的NIH效力测定方法进行^［4］。

　　1.7　狂犬病毒抗体测定　狂犬病毒IgG抗体测定用ELISA方法，以IPRV包被，用标记过氧化物酶的IgG作为第二抗体，IgG参考品是用中和抗体标准品标定的小白鼠抗血清，以EU/ml表达。

　　中和抗体测定用快速狂犬病毒荧光灶抑制试验(RFFIT)法。待测定血清56℃30分钟灭活，以CVS细胞适应株作毒种，选用能使80%细胞感染的病毒量与不同稀释度的抗血清混合，置5%CO₂温箱内孵育1小时。在微孔塑料板上加入BHK₂₁细胞，每孔50 000个，置CO₂温箱24小时。弃去上清液，用80%丙酮于室温固定30分钟，真空吹干，加入标记荧光素的抗狂犬病毒核蛋白抗体，置37℃30分钟，弃去上清液。用PBS洗2次，加入甘油。在荧光显微镜下观察，记录每孔细胞荧光灶百分比，计算出与病毒对照减少50%病毒对照细胞荧光灶的被检抗体的稀释度，并通过与标准品比较，计算出被测血清的抗体效价(IU)。标准品为人抗狂犬病毒IgG。

　　2　结果

　　2.1　铝佐剂对狂犬病疫苗产生IgG和中和抗体的影响　用IPRV和Al₂O₃IPRV皮下免疫OF₁小白鼠(注射量IPRV1.67 μg/只，Al₂O₃ 75 μg/只)，按0、3、7、14、30天免疫5次，其间不同天数从小白鼠眼眶静脉采血，分离血清，灭活后用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测IgG抗体，用RFFIT方法检测中和抗体。

　　结果表明Al₂O₃与IPRV复合后，免疫第4天和第7天的抗体水平反而明显下降，直至14天后的检查才见促进抗体升高(表1)。

　　2.2　铝佐剂对狂犬病疫苗ED₅₀的影响　用相同量的IPRV单独或与不同剂量的Al₂O₃复合，按照美国国立卫生研究院(NIH)方法，于0，7天免疫，第14天用CVS病毒脑内攻击，观察死亡率，计算ED₅₀。

　　结果表明与单独用IPRV相比，Al₂O₃IPRV减少ED₅₀抗原量1倍(表2)。

表1　用IPRV或Al₂O₃IPRV免疫OF₁小白鼠不同时间

　　测定抗狂犬病毒IgG和中和抗体的滴度

　　Tab.1　Titration of IgG and neutralization antibody to

　　rabies virus at different days in OF₁ mice after

　　immunized with IPRV and Al₂O₃ IPRV

表2　用NIH方法检测铝佐剂对IPRV效价的促进作用

　　Tab.2　The promoting effect of Al₂O₃adjuvant

　　on IPRV tested by NIH efficacy test

　　2.3　铝佐剂对暴露后小白鼠死亡率的影响　我们模仿狂犬病现场实际，先用WRVS 9 147狂犬病野毒株1.5×10⁶icLD₅₀/0.1 ml病毒皮下感染OF₁小白鼠，0.1 ml/只，于感染后6小时、3、7、14天将Al₂O₃单独或分别用与140 ng/只、560 ng/只的IPRV复合后治疗小白鼠，观察死亡率，并与单纯使用IPRV组小鼠比较。

　　结果在没有IPRV的情况下，病毒对照组小白鼠死亡95%，Al₂O₃组死亡100%；在注射IPRV140 ng/只情况下，单独IPRV组小白鼠死亡率仍为95%，与Al₂O₃复合后，死亡率仍为95%；在注射IPRV560 ng/只情况下，IPRV组小白鼠死亡率为70%，与Al₂O₃复合组的死亡率也为70%(表3)。表明狂犬病疫苗加入铝佐剂后，对感染后的小白鼠没有进一步的防治效果。

表3　铝佐剂或铝佐剂IPRV对感染狂犬病毒

　　野毒株WRVS 9 147小白鼠的治疗效果

　　Tab.3　The therapeutic effect of Al₂O₃ or Al₂O₃ IPRV on

　　wild-type rabies virus infected WRVS 9 147 mice

　　*：小鼠死亡数/感染狂犬病毒的小鼠数

　　*：No.of dead mice/No.of mice infected with rabies virus3　讨论

　　有报道铝佐剂吸附抗原后在体内形成抗原库，缓慢释放抗原^［5，6］。与其他病毒性传染病的预防不同，对暴露后狂犬病的预防要清洗伤口，施用抗狂犬病毒免疫球蛋白和疫苗。尽管抗狂犬病免疫球蛋白对疫苗的免疫反应有抑制作用，但又是必须的，很多现场观察证实了这一点。因此要求狂犬病疫苗既要效价高又要产生抗体早，才能救人性命。铝佐剂虽然能提高狂犬病疫苗后期抗体滴度，却推迟早期抗体的产生，这与铝佐剂作用机理吻合，但对暴露后狂犬病的防治十分不利。虽然铝佐剂在NIH效力测定中能促进疫苗效价，但NIH效力试验不符合狂犬病现场实际^［7］，攻击毒CVS不是流行区的街毒或强毒；脑内攻击途径非自然感染途径；特别是与对人的暴露后免疫不同，NIH法对小白鼠在暴露前免疫2针，第14天才脑内攻击，而铝佐剂恰恰至此才提高疫苗抗体滴度，其结果没有反映出延缓机体产生有效抗体这样重要的事实，因而效力结果具有一定程度的假象，这种对人的认识产生错觉更是有害的。目前国际上要求高质量的狂犬病疫苗能在免疫后7～10天产生有效抗体，我国有的地方用免疫后45～60天的血样，比较进口和国产铝佐剂狂犬病疫苗的质量^［8］，显然是没有多大意义的。为了进一步验证铝佐剂对狂犬病疫苗的作用，我们模仿狂犬病现场实际，使用强毒株皮下感染小白鼠，感染后再免疫，结果也表明铝佐剂对狂犬病疫苗没有任何促进作用。

　　我们建议有关部门研究一下在我国现行狂犬病疫苗中是否应该加入铝佐剂，并在人体中进行比较，如结果与我们的实验研究相似，则应尽早在我国现行狂犬病疫苗中去掉铝佐剂。

　　参考文献

　　［1］中华人民共和国卫生部.人用浓缩狂犬病疫苗制造和检定规程.中国生物制品规程一部，1995.121.

　　［2］Macpherson I, Stocker M. Polyoma transformation of hamster cell clones:an investigation of genetic factors affecting cell competence. Virology, 1962, 16:147-151.

　　［3］WHO. Transfer of technology for rabies vaccine production: new strains available for Vero and BHK21 cell cultures. Bull WHO, 1987, 65:941.

　　［4］Seligmann E. The NIH test for potency. Lab Tech Rabies, 1973, 33:279-286.

　　［5］Nicklas W. Aluminum salt. Res Immune 1992, 143:489.

　　［6］Rajesh K G, Edgar H R. Erik B L, et al. Ajuvants-balance between toxity and aduvanticity. Vaccine, 1993, 11:293.

　　［7］林海祥，俞永新.狂犬病疫苗的效力测定及参考标准品的发展.微生物学免疫学进展，1987， 3：1.

　　［8］黄祖星，陈爱贞，梅重卿，等.进口、国产人用狂犬病疫苗免疫后中和抗体水平测定.微生物学免疫学进展，1997，25：40.

(收稿：1998-04-07　　修回：1999-01-04)