IL-2基因修饰增强白血病抗原冲击的树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫反应

中华血液学杂志 1999年第11期第20卷 论　著

作者：唐华　曹雪涛　朱学军　张明徽　袁正隆　于益芝　章卫平

单位：曹雪涛、朱学军、张明徽、袁正隆、于益芝、章卫平200433　上海，第二军医大学免疫学教研室；唐　华　现在河南省人民医院生物治疗中心

　　关键词： 树突细胞；白细胞介素2；基因疗法；T淋巴细胞，细胞毒性；疫苗；白血病

　　【摘要】　目的　研究腺病毒介导的白细胞介素(IL)2基因修饰能否使抗原冲击的树突状细胞(DC)在体内诱导出更强的抗肿瘤免疫反应。方法　用小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)和mIL-4扩增出的小鼠骨髓DC在FBL-3红白血病细胞冻融抗原冲击的同时转染IL-2腺病毒，观察其体外分泌IL-2的水平、刺激T细胞增殖的能力，其体内皮下免疫后小鼠引流淋巴结细胞数和组分的变化以及诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和免疫保护的能力。结果　IL-2基因修饰的抗原冲击的DC，在体外能分泌较高水平的IL-2，具有显著刺激同基因小鼠脾脏T细胞增殖的能力，DC体内免疫后能使小鼠引流区淋巴结细胞数显著增加；FBL-3抗原冲击的DC能诱导产生FBL-3细胞特异性CTL活性，联合mIL-2基因修饰后，所诱导的杀伤细胞对FBL-3细胞的杀伤活性更强，能更显著地提高和延长野生型FBL-3细胞再攻击的小鼠生存率和存活期。结论　IL-2基因修饰能使抗原冲击的DC诱导机体产生更强的抗肿瘤免疫反应。

Induction of potent antitumor immune response of leukemia antigen-pulsed dendritic cells by IL-2 gene modification

TANG Hua, CAO Xuetao, ZHU Xuejun, et al.

　　Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai　200433

　　【Abstract】　Objective　To investigate whether adenovirus-mediated IL-2 gene modification can improve antitumor immunity of the tumor antigen-pulsed dendritic cells(DC) in vivo.Methods　 DC were generated from bone marrow, then, pulsed with FBL-3 erythroleukemia cell lysates and transfected with IL-2 gene simultaneously. IL-2 secretion and T cell stimulating activity of the DC were detected. The number and cell subsets of draining lymph nodes, cytotoxic lymphocyte(CTL) activity ,and the increase of protective effect for the mice s.c vaccinated with DC were observed.Results　 IL-2 gene-modified, antigen-pulsed DC could secrete high level of IL-2 in vitro, stimulate proliferation of syngeneic T cells markedly. DC vaccine could increase the number of draining lymph node and induce CTL activity, which directed to FBL-3, more significantly. After the DC vaccination, the survival time of the mice challenged with wild-type FBL-3 cells were prolonged.Conclusion　 Antitumor immune response could be induced more potently by vaccination with IL-2 gene modified, antigen-pulsed DC.

　　【Key words】　Dendritic cells　　Interleukin-2　　Gene therapy　　T-lymphocytes, cytotoxic　　Vaccines　　Leukemia

　　树突状细胞（dendritic cell, DC）是目前所知的最有效的激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞（antigen-presenting cell, APC），也是功能最强的APC，在肿瘤免疫治疗中具有独特的地位^［1］。Porgodor等^［2，3］发现用MHC Ⅰ类分子限制性抗原多肽冲击致敏从小鼠骨髓诱导的DC可以在体内诱导产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并发现经抗原肽冲击致敏的DC皮下免疫的小鼠可以产生特异的抗肿瘤效应。DeMatos等^［4］报道用冻融抗原(lysates)冲击的DC免疫小鼠，可抑制肿瘤的肝转移。我们曾用重组腺病毒介导粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因转染的DC体内诱导产生了较强的抗肿瘤免疫反应^［5,6］。白细胞介素(IL)2具有激活并促使T细胞增殖的作用，IL-2基因转染的瘤苗体内免疫后可刺激体内CTL的产生，并且对其后野生型肿瘤细胞的再攻击具有抵抗作用，对某些荷瘤小鼠具有一定的治疗效果^［7］。我们探讨了经IL-2基因修饰的DC抗原冲击后，能否诱导FBL-3红白血病小鼠产生更强的抗肿瘤免疫反应。

　　材料和方法

　　1　动物和细胞株　C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，购自上海必凯实验动物有限公司。小鼠红白血病细胞株FBL-3由美国克利夫兰医学中心陈卫博士惠赠。小鼠黑色素瘤细胞株B16由本室常规传代。

　　2　主要试剂　携带mIL-2基因的重组腺病毒载体Adex 1 cAmIL-2(AdIL-2)及携带LacZ基因的重组腺病毒载体Adex 1 cAmLacZ(AdLacZ)由日本癌症研究基金会Hamada博士惠赠，小鼠IL-2 ELISA检测试剂盒为Endogen公司产品，同位素³H-TdR、Na₂　⁵¹CrO₄为Amersham公司产品，大鼠抗小鼠单抗CD₃-PE、CD₄-PE、CD₈-PE、NK1.1-PE和FITC标记的羊抗大鼠荧光二抗均购自Pharmingen公司，抗小鼠CD₄、CD₈、B220/CD_45R、Ia、FcR和33D1单抗为本室常规培养的杂交瘤培养上清，mGM-CSF和mIL-4均购自Sigma公司，IL-2为Genzyme公司产品。

　　3　FBL-3细胞冻融抗原的制备　收集处于对数生长期的FBL-3细胞，用RPMI 1640培养基配成1×10⁷/ml的细胞悬液，-20 ℃反复冻融4次，5 000 r/min离心30分钟，收集上清，经直径0.22 μm微孔滤膜过滤后作为冻融抗原备用。

　　4　骨髓DC的培养　参考Inaba等的方法^［8］略作修改，取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，溶去红细胞后，用大鼠抗小鼠CD₄、CD₈、B220/CD_45R、Ia和FcR混合单抗液重悬，4 ℃孵育45分钟，洗涤后加入低毒性兔补体（1∶10稀释），37 ℃介溶45分钟，PBS洗两次后用含重组mGM-CSF(3.3 ng/ml)和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基于24孔板中培养(细胞浓度为1×10⁶/ml)。第2天，轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，补入新鲜的含同样浓度mGM-CSF和mIL-4的完全培养基，第6天收集非粘附细胞和疏松粘附的增殖性树突状细胞聚集体，于培养瓶中继续培养2天，收集悬浮的细胞即为DC。

　　5　DC的抗原冲击和基因修饰　收集第8天的DC，调整至1×10⁶/ml，加入冻融抗原(抗原与DC之比为5∶1，抗原量以冻融前FBL-3细胞的数量计)，同时按多重感染指数(MOI)值20加入AdIL-2或AdLacZ，置37 ℃孵育16小时，每隔半小时轻轻振荡混匀，PBS洗3次后收集备用。X-gal染色显示AdLacZ的转染率达90％以上。

　　6　DC分泌IL-2水平的检测　分别收集24小时和48小时的DC(5×10⁵/ml)培养上清，采用ELISA方法检测IL-2分泌量，具体操作按试剂盒说明书进行。

　　7　DC的T细胞刺激活性　将上述处理的DC，用终浓度为25 μg/ml的丝裂霉素C 37 ℃孵育45分钟，洗2次，作为刺激细胞。取经灭活FBL-3细胞免疫1周后的C57BL/6小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，Tris-NH₄Cl溶解红细胞，洗2次后注入尼龙毛柱，置37 ℃孵育1小时，冲洗出非粘附细胞作为T细胞，即反应细胞。将DC与T细胞以1∶50的比例在96孔培养板上混合培养5天，于结束培养前16小时加入³H-TdR(37kBq/孔)，常规收集细胞，置WALLAC1409液闪仪上检测，计放射性核素每分钟闪烁计数(CPM)值，结果用3复孔均值表示。

　　8　DC免疫小鼠引流区淋巴结数量的变化及细胞组分的流式细胞仪(FACS)分析　DC以3.5×10⁵/只接种于C57BL/6小鼠的右后股外侧皮下，取免疫1周后各组小鼠右后腹股沟淋巴结，制成淋巴结单细胞悬液，计数，并用大鼠抗小鼠CD₃-PE、CD₄-PE、CD₈-PE、NK1.1-PE、33D1单克隆抗体于4 ℃孵育30分钟后洗2次，对于需间接标记的33D1样本管，加入FITC-羊抗大鼠单抗，4 ℃标记30分钟后洗2次，FACS(Calibur, BD)检测细胞表型。

　　9　CTL体外诱导和杀伤活性的检测　DC免疫7天后取脾脏T细胞（5×10⁶/ml）与 灭活的FBL-3细胞按20∶1的比例，在含IL-2 100 U/ml的RPMI 1640完全培养基中培养，第7天收集活细胞作为效应细胞，⁵¹Cr标记1小时的FBL-3为靶细胞，同时设⁵¹Cr标记1小时的B16为靶细胞对照，以100∶1的效靶比，用4小时⁵¹Cr释放法检测CTL活性，同时设最大释放组和自然释放组。

　　10　野生型FBL-3细胞的再攻击　于DC免疫1周后，腹腔注射野生型FBL-3细胞(5×10⁶/只)，每组10只，观察小鼠的生存率及存活期。

　　结　果

　　1　基因修饰抗原冲击的DC分泌IL-2的水平　mIL-2基因修饰的DC在24小时和48小时都能分泌高水平的IL-2。在24小时和48小时，单用mIL-2基因修饰的DC分泌IL-2的量分别为(5.13±0.12) ng/ml和(7.50±0.18) ng/ml；mIL-2基因修饰的抗原冲击致敏的DC分泌IL-2的量分别为(4.97±0.11) ng/ml和(7.32±0.15) ng/ml。mIL-2基因修饰的DC与mIL-2基因修饰的抗原冲击致敏的DC分泌IL-2的水平相比较，在24小时和48小时，差异均无显著性(P＞0.05)。其它未用mIL-2基因修饰的各组DC无IL-2分泌。

　　2　mIL-2基因修饰/抗原冲击致敏的DC的抗原提呈能力　抗原冲击的DC能刺激同基因的小鼠脾脏T细胞增殖，与未经抗原冲击致敏的DC相比，差异显著(P＜0.05)；经mIL-2基因修饰的DC，即使没有抗原冲击，也能使脾脏T细胞增殖(CPM值为3 568±247)，但显著低于经抗原冲击的DC(P＜0.05)；mIL-2基因修饰的抗原冲击的DC能非常显著地刺激脾脏T细胞增殖(CPM值为11 878±1 029)，与其它各组相比，差异有显著性(P＜0.05)。

　　3　DC免疫后小鼠引流区淋巴结细胞量及组分的变化　凡经抗原冲击致敏的DC免疫过的小鼠引流区淋巴结细胞数比非抗原冲击致敏DC组显著增多(P＜0.05)；在经抗原冲击致敏的DC免疫的各组小鼠之间，mIL-2基因修饰过的DC组小鼠引流区淋巴结细胞数［(8.3±1.1)×10⁶］比其它各组小鼠显著增多(P＜0.05)；未经抗原冲击致敏的DC免疫的各组小鼠之间，mIL-2基因修饰的DC免疫小鼠的引流区淋巴结细胞数［(2.3±0.28)×10⁶］比其它各组也显著增多(P＜0.05)。FACS检测表型发现，各组CD₃、CD₄、CD₈、NK1.1和33D1的含量以及CD₄/CD₈的比值没有明显的变化(结果未显示)。

　　4　DC免疫后诱导的CTL的水平　如图1所示， FBL-3抗原冲击DC免疫小鼠后能诱导出FBL-3细胞特异CTL(对B16细胞无杀伤活性)，其中mIL-2基因修饰联合FBL-3抗原冲击的DC免疫小鼠的CTL,对FBL-3细胞的CTL杀伤活性显著高于其它各组(P＜0.05)。从本实验结果中也观察到：单用mIL-2基因修饰的DC免疫的小鼠所诱导的杀伤细胞对FBL-3细胞和B16细胞都呈现一定的杀伤活性，说明mIL-2基因修饰的DC有可能通过体内分泌IL-2非特异性地激活杀伤细胞有关。

1：PBS/FBL-3；2：PBS/B16；3：DC/FBL-3；4：DC/B16；5：lysates-DC/FBL-3；6:lysates-DC/B16;7:AdLacZ-DC/FBL-3；8：AdLacZ-DC/B16;9:AdIL-2-DC/FBL-3；10：AdIL-2-DC/B16;11:lysates-AdIL-2-DC/FBL-3；12：lysates-AdIL-2-DC/B16;13:lysates-AdLacZ-DC/FBL-3;14:lysates-AdLacZ-DC/B16

1　DC免疫诱导的小鼠CTL杀伤活性

　　5　DC免疫对野生型FBL-3细胞再攻击的保护作用　抗原冲击致敏的DC免疫小鼠的生存率和存活期都明显提高和延长，在观察期内，mIL-2基因修饰的抗原冲击致敏的DC免疫小鼠的生存率为100％，明显高于其它各组。表明IL-2基因修饰可明显提高抗原冲击致敏的DC体内诱导抗肿瘤免疫反应的水平，从而增强了小鼠抵抗肿瘤再攻击的能力(图2)。

3　DC免疫后小鼠的生存率和存活期

　　讨　论

　　DC在机体免疫应答的启动中起重要的作用。各器官的DC在摄取抗原后，由外周逐渐向次级淋巴器官迁移，并在此过程中逐渐发育成熟，表现为MHCⅠ、Ⅱ类分子，粘附分子及共刺激分子的表达上调，最终到达次级淋巴器官完成免疫激发功能。DC的MHC分子的表达上调导致其抗原提呈功能增强，ICAM-1、ICAM-3等粘附分子的表达有利于DC与T细胞形成稳定的DC-T细胞聚集体，而B7、CD₄₀等共刺激分子的上调则是激活T细胞所必需的，因为没有共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的失能(anergy)。肿瘤的免疫逃逸机制之一，是因为肿瘤不表达B7等共刺激分子。而部分研究显示体外诱导T细胞失能与IL-2的缺乏有关，加入IL-2可以阻止T细胞失能的形成。

　　正是基于以上的认识，我们设想，如果用抗原冲击致敏DC并联合mIL-2基因修饰，则可以既发挥抗原冲击致敏的DC特异的抗原提呈功能，启动特异性免疫应答的作用，同时，DC也是具有自动迁移特性的载体，可移行至淋巴器官，既携带抗原也携带mIL-2基因并分泌IL-2，后者对阻止T细胞失能和放大特异免疫应答的效应起重要作用。

　　在本实验中，我们将DC用FBL-3细胞冻融抗原冲击并联合转染mIL-2腺病毒，经ELISA检测表明，mIL-2基因修饰后24小时和48小时，DC都能分泌较高水平的IL-2，同时T细胞刺激实验也显示，抗原冲击致敏的DC能显著刺激同基因小鼠T细胞增殖，其中mIL-2基因修饰的DC刺激T细胞增殖能力更强，表明经抗原冲击联合mIL-2基因修饰可以使DC具有更强的诱导CTL的能力。

　　DC皮下免疫小鼠的引流区淋巴结细胞计数显示，抗原冲击致敏的DC各组与其它各组相比，数量显著增加。但FACS检测并未显示存在组分上的差别，原因并不明确。FBL-3抗原冲击的DC诱导的CTL，对FBL-3有较高的杀伤活性，而对B16没有杀伤活性，表明FBL-3抗原冲击的DC所诱导的CTL是FBL-3特异的；FBL-3抗原冲击联合mIL-2基因修饰DC组诱导的CTL，对FBL-3的杀伤活性显著高于其它各组，表明FBL-3抗原冲击的DC不但迁移至引流区淋巴结，发挥了抗原提呈、诱导CTL产生的功能，同时联合IL-2基因修饰还使DC发挥了旁分泌IL-2的作用，使T细胞被携带抗原的DC激活的同时，在IL-2的作用下进一步扩增，某种程度上发挥了CD₄⁺T细胞的辅助功能。但是实验结果也显示单用mIL-2基因修饰的DC免疫的小鼠，可以产生一定程度的针对B16的杀伤活性，说明基因修饰可能激活NK等非特异性免疫效应细胞。进一步的实验表明，mIL-2基因修饰的抗原冲击致敏的DC可以使FBL-3细胞再攻击的小鼠存活率及生存期显著提高和延长，说明DC经抗原冲击联合mIL-2基因修饰处理后，在体内可诱导产生显著的免疫保护作用。

　　目前国外已有抗原基因修饰DC体内诱导抗肿瘤效应的研究报道^［9，10］，我们的工作则证明用IL-2基因修饰能显著增强肿瘤抗原体外冲击的DC体内诱导的抗肿瘤免疫反应，并取得了更强的免疫保护效果。

　　本课题受国家自然科学基金重点项目(39730420)资助

　　参考文献

　　1　曹雪涛.树突状细胞的基础与临床的研究新进展.中国免疫学杂志，1998，14：161-168.

　　2　Porgodor A, Gilboa E. Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with a class Ⅰ restricted peptide are potent inducer of cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med, 1995，182:255-260.

　　3　Porgodor A, Snyder D, Gilboa E. Induction of antitumor immunity using bone marrow-generated dendritic cells. J Immunol, 1996，156:2918-2926.

　　4　DeMatos P, Abdel-Wahab Z, Vervaevt C, et al. Vaecination with dendritic cells inhibits the growth of hepatic metastases in B6 mice. Cell Immunol, 1998，185:65-74.

　　5　曹雪涛，章卫平，马施华，等. GM-CSF基因转染增强经肿瘤抗原刺激的树突状细胞的体内抗肿瘤作用. 中国科学(C辑)，1997，27：354-378.

　　6　章卫平，曹雪涛，黄欣，等. 基因修饰的树突状细胞融合后的瘤苗抗肿瘤免疫应答的实验研究. 中华医学杂志，1997，77：39-41.

　　7　Connor J, Bannerji R, Saito S, et al. Regression of bladder tumors in mice treated with interleukin-2 gene modified tumor cells. J Exp Med, 1993，177:1127-1134.

　　8　Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with GM-CSF.J Exp Med, 1992， 176:1693-1702.

　　9　McArthur JG, Mulligan RC. Induction of protective anti-tumor immunity by gene-modified dendritic cells. J Immunother, 1998，21:41-47.

　　10　Wan Y, Bramson J, Carter R, et al. Dendritic cells transduced with an adenoviral vector encoding a model tumor-associated antigen for tumor vaccination. Human Gene Ther,1997,8:1355-1363.

收稿：1998-09-21　　修回：1999-04-12