精制Vero细胞狂犬病疫苗的临床观察及免疫学效果研究

中华实验和临床病毒学杂志 2000年第1期第14卷 论著

作者：董关木　郑海发　刘增顺　吴小红　谢世宏　赵君能　朱凤才　李荣健　宁一文

单位：董关木（100050　北京，中国药品生物制品检定所疫苗一室）；郑海发（100050　北京，中国药品生物制品检定所疫苗一室）；刘增顺（100050　北京，中国药品生物制品检定所疫苗一室）；吴小红（100050　北京，中国药品生物制品检定所疫苗一室）；谢世宏（四川省卫生防疫站病毒所）；赵君能（江苏省镇江市卫生防疫站防疫科）

　　关键词： Vero细胞；狂犬病疫苗；临床试验；中和试验

　　【摘要】　目的　目前我国使用的人用狂犬病疫苗生产工艺较落后，致使使用后副反应较严重，而国际上Vero细胞狂犬病疫苗已研制成功和使用近20年，不仅免疫效果良好而且副反应很轻。为了改变我国狂犬病疫苗生产工艺的落后和质量较差的状况，而开展此项研究。方法　海南省生物制品研究所和河南省生物技术研究所联合研制的Vero细胞狂犬病疫苗获得卫生部批准进行临床观察，该疫苗以aG株适应Vero细胞后为生产毒种，转瓶培养、并浓缩适当倍数后经sepharose FF 4B柱层析纯化后制备成疫苗。临床观察分两个阶段进行，第Ⅰ阶段接种30人，第Ⅱ阶段接种318人。结果　全部受试者仅显示12%的轻度副反应，无中强度副反应；不管以暴露前或暴露后方案接种，全程注射后的中和抗体阳转率均为100%。中和抗体GMI 2.89～5.29 IU/ml。该疫苗经临床观察和中和抗体测定的结果显示，副反应轻微，且有良好的中和抗体应答。结论　精制Vero细胞狂犬病疫苗对人体安全且具有较好的免疫原性。

Studies on clinical trials and immune effect of a new purified rabies vaccine prepared from Vero cells

DONG Guanmu, ZHENG Haifa, LIU Zengshun, et al.

　　（National Institute for the Control of Phamaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China）

　　【Abstract】　Objective　To observe the safety and neutralizing antibody response of a new purified rabies vaccine prepared from Vero cells. Methods　The vaccine used was manufactured in Hainan Institute of Biologicals and licensed by the Ministry of Health for clinical trials. The vaccine was administrated in 30 and 318 volunteers during phase Ⅰ and Ⅱ clinical trials with pre-exposure (day 0, 7, and 28) or post exposure(day 0,3,7,14 and 28) vaccination schedules. The “Verorab(PVRV),” a rabies vaccine made in France was used as control.Results　The results showed that the new purified vaccine did not cause any severe and moderate side reactions, the slight side reaction rate was 12% including those complained by vaccinees themselves. The immunological effect was determined by detecting neutralizing antibody with mouse neutralization test (NIH). The positive seroconversion rates of neutralizing antibody were 100% (n=27 GMT 2.89 IU/ml) and 100% (n=30, GMT 5.29 IU/ml) respectively by pre-exposure and post-exposure schedules. No significant difference was found when compared with France “Verorab” vaccine by pre-exposure schedule (n=24, GMT 2.13 IU/ml). Conclusion　The clinical trials indicated that the purified rabies vaccine prepared from Vero cells only showed slight side reaction and had good neutralizing antibody response. Therefore this new vaccine is safe and protective for prevention of rabies in human.

　　【Key words】　Vero cells; Rabies vaccine; Clinical trials; Neutralization tests

　　狂犬病是一种病死率极高的人兽共患传染病，无特殊有效的治疗药物和方法，唯一有效的手段就是注射高质量的狂犬疫苗并联合使用抗狂犬病血清或免疫球蛋白。因此，疫苗注射后是否有效对挽救病人生命起到决定性作用。我国自1984年获卫生部批准使用的原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗到90年代初一直为粗制原苗，不浓缩，不纯化精制，疫苗效价达不到WHO规定的≥2.5 IU/剂，免疫效果较差。1993年卫生部要求进行3～5倍浓缩的工艺改进，虽然疫苗效价有所提高，但注射后副反应亦直线上升，注射部位剧烈疼痛，大面积红肿、硬结，全身性荨麻疹，神经性水肿以及脏器的病变，甚至休克，乃至死亡^［1～3］。

　　发达国家生产和使用的狂犬病疫苗均为精制纯化疫苗，尤其是法国巴斯德-梅里厄公司生产的Vero细胞狂犬病疫苗具有多项优点^［4］。为此，我国部份科研单位和疫苗生产企业根据我国的具体国情和条件，在卫生行政部门的支持下，对此项工作进行了研究。海南省生物制品研究所和河南省生物技术研究所联合研制的Vero细胞狂犬病疫苗在1998年上半年率先获得卫生部新生物制品的人体观察许可。为此，我们对该疫苗进行了第Ⅰ阶段和第Ⅱ阶段临床观察，现将结果报告如下：

　　1　材料和方法

　　1.1　疫苗

　　1.1.1　aG株Vero细胞狂犬病疫苗(简称海南苗)　该疫苗由海南省生研所和河南省生物技术所联合研制而成。该疫苗以Vero细胞为生产基质，aG株狂犬病毒固定毒为生产毒种^［5］，转瓶培养细胞接种病毒后制备病毒原液，用Millipor超滤浓缩装置进行浓缩适当倍数，以β-丙内酯为灭活剂，Sepharose FF 4B柱层析纯化，加氢氧化铝为佐剂，疫苗效力≥7.70 IU/剂、每剂1 ml，5剂为1人份，质量标准符合WHO规程的相关标准，并获得国家药品监督管理局批准进行临床观察研究。

　　1.1.2　维尔博(PVRV)疫苗　该疫苗为法国巴斯德-梅里厄公司生产的商品化狂犬病疫苗，以Vero细胞为生产基质，PM/WI-38-1503株狂犬病毒固定毒为生产毒种，冻干剂型，0.5 ml/剂，5剂为1人份，批号No.764-2，作为本次观察的对照疫苗之用。

　　1.2　接种对象、免疫程序和分组　临床观察方案按国家药品监督管理局批准的要求执行。

　　1.2.1　接种对象　本次人体观察由检定所、广西自治区、四川省和江苏省卫生防疫站共同完成，接种对象分别由广西、四川、江苏等地的驻军、学生、农民和城镇居民组成、具有广泛的代表性(表1)。

表1　海南Vero细胞狂犬疫苗第Ⅰ、Ⅱ阶段临床观察现场安排

　　Tab.1　Observation on Hainan Rabies vaccine (prepared in Vero cells) of Phase Ⅰ and Ⅱ clinical trials

　　1.2.2　免疫程序　第Ⅰ阶段按WHO推荐的暴露前程序，即0，7，28天各接种一剂，共注射三剂。试验组接种海南苗30人，对照组接种维尔博疫苗30人，均在广西进行^［6］。第Ⅱ阶段扩大观察318人；江苏省观察点接种100人、其中30人按暴露后程序接种，即全程5针注射，免疫前后采血以备测定中和抗体水平及阳转率；四川观察点接种106人，其中18人和17人分别接种0.5ml/次和1.0ml/次，按暴露后程序接种(即全程5针)；广西观察点接种112人，其中32人接种5针，0.5 ml/针。

　　1.2.3　副反应观察　在疫苗注射前进行身体检查，符合条件的进行登记并在每针注射后的当时，12，24和48h进行体温测量，注射部位局部检查，主诉症状如恶心、呕吐、倦怠等13项问诊。副反应强、中、弱程度标准的判断按文献［7］要求实施。每人一表进行登记，最后统计处理。

　　1.2.4　免疫效果观察　以采集全程免疫后的血清测定中和抗体水平，方法为小鼠体内法^［8］，并以WHO要求≥0.5 IU/ml血清为阳转的标准。

　　2　结果

　　2.1　副反应观察　第Ⅰ阶段观察中，法国维尔博疫苗和海南Vero细胞疫苗各注射30人，两种疫苗均无任何副反应发生。第Ⅱ阶段，用暴露前免疫程序(1.0 ml×3剂)共注射221人，全身反应9人，局部反应9人，反应率分别为4.07%；总反应18人，反应率8.14%。按暴露后免疫程序共注射97人，其中全量组(1.0 ml×5剂)注射47人，半量组(0.5 ml×5剂)注射50人，反应人数分别为17人和7人，反应率分别为36.17%和14.00%。在全部第Ⅱ阶段观察中，共注射318人，全身反应18例，反应率5.66%。局部反应24例，反应率7.54%，全身反应和局部反应共42人，总反应率为13.21%。详见表2、3。

表2　不同观察点接种疫苗后副反应发生率

　　Tab.2　Distribution pattern of side effects after vaccination at different observed spots

　　注：(-)：无反应. No side effects

表3　不同剂量的副反应发生率

　　Tab.3　Rate of side reaction after vaccination with different dosages

　　2.2　免疫学效果　中和抗体测定结果见表4和表5。表4结果显示，第Ⅰ阶段两种疫苗均按WHO推荐的暴露前程序注射，海南苗和法国苗中和抗体GMT分别为2.89 IU/ml(0.7～6.8 IU/ml)和2.13 IU/ml(0.7～21.7 IU/ml)，阳转率均为100%，两者无统计学差异。表5结果显示1.0 ml×5剂和0.5 ml×5剂的中和抗体滴度，GMT分别为4.42 IU/ml和5.29 IU/ml，阳转率均为100%。

表4　第Ⅰ阶段(海南疫苗)和Verorab疫苗中和抗体比较

　　Tab.4　Comparison of neutralizing antibody between Hainan vaccine and “Verorab” vaccine in the Phase Ⅰ trial

　　t=0.67　P＞0.2

表5　不同剂量产生中和抗体水平的比较

　　Tab.5　Comparison of neutralizing antibodies when vaccinated with different dosages

　　3　讨论　　众所周知，狂犬病至今无特殊治疗方法和特殊药物，唯一有效的是注射高质量的狂犬疫苗并联合给予高质量的特异性抗狂犬病血清或免疫球蛋白以阻止狂犬病的发生。WHO推荐有效狂犬病疫苗的最低效价应≥2.5 IU/剂，而疫苗接种后产生的血清中和抗体须达到0.5 IU/ml以上才被认为能有效保护^［9～11］。虽然有许多资料证明地鼠肾细胞狂犬病疫苗有较好的免疫原性，但由于是不浓缩的原苗或仅浓缩而不纯化精制的疫苗，所以效果较差，或中、强度的副反应发生率较高^［12］。严重的不良反应发生率为5%～10%，这些副反应大都需要临床处理才能缓解，需要住院治疗的亦常有报道，且多数不得不中断注射，不能完成全程免疫。而这些报道的资料均未将按临床观察副反应分级中的较轻微的反应统计在内。我们在第Ⅰ阶段观察中PVRV和海南苗均无任何副反应。而第Ⅱ阶段观察结果显示，全身和局部副反应分别为5.66%和7.54%。如按不同剂量和不同免疫程序分析，则以1.0 ml×5剂为最高，反应率为36.17%(17/47)；0.5 ml×5剂组次之，反应率为14.00%(7/50)；而以1.0 ml×3剂组最低，反应率为7.17%(18/251)。与德国埃林大学医学院WHO合作中心，墨尼黑大学等6个单位对88例健康志愿者接种鸡胚细胞狂犬病疫苗(PCEC)后全身和局部副反应分别为16.4%和15.1%相仿^［12］。另外，Scheier-mann等报道的219例接种PCEC疫苗的局部副反应达35%，与本次观察结果相似^［13］。

　　但如与第Ⅰ阶段广西点接种PVRV和海南苗均无副反应发生和第Ⅱ阶段江苏点1.0 ml×3剂组无副反应的现象分析，其副反应的发生率似乎与受试人群、观察人员对副反应程度的衡量不无关系。需要说明的是在全部观察中，除1例体温为37.6℃属中等程度副反应外，其余均在轻微反应范围内，24小时内即自行消失，这是粗制的原浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗无法比拟的。

　　在第Ⅱ阶段扩大观察和免疫效果中，1.0 ml×5剂组的中和抗体GMT水平较低于0.5 ml×5剂组，这可能与受试人群的地区差异或人群特性有关。由于0.5 ml×5剂组是在狂犬病高发区的广西自治区进行，而该地区的居民以往接种过狂犬病疫苗的可能性较大，该组中和抗体≥17.2～34.32 IU/ml的有4人，与导致该组的中和抗体稍高有关。另外，是否可能由于机体的免疫系统对抗原具有最适剂量或受试者的个体差异造成此现象，尚需进一步加以研究和总结。

　　参考文献

　　1，孙玉琴，宋来臣，孙庆申.狂犬病疫苗引起继发性血小板减少性紫癜1例.新医学，1994，256：29.

　　2，杨修兰，阎富华.狂犬疫苗引起再生障碍性贫血一例报告.中华血液学杂志，1988，9：115.

　　3，陆裕宽，唐小萍，陆家华，等.浓缩狂犬病疫苗接种后不良反应与血清抗体水平分析.微生物学免疫学进展.1997，25：1-3.

　　4，Chantapong W,Paramet G, Prasert T, et al. Progress and achievement of rabies control in Thailand. Vaccine,1997,15(Supp1):7-11.

　　5，林放涛，曾蓉芳，曾敏珍，等.狂犬病毒固定毒“北京株”在地鼠肾细胞培养中的适应及其生物学性状的研究.病毒学集刊，1982，2：65-67.

　　6，WHO. Requirements for rabies vaccine for human use, WHO export committee on biological standardization, thirty-first report, Geneva, WHO, 1981, (WHO, Technical Report Series,No.658)Annex.

　　7，陆隆沫，曾繁珍，杨启和，等.地鼠肾组织培养狂犬病灭活疫苗健康人群接种反应观察和血清抗体测定.病毒学集刊，1982，2：81-82.

　　8，WHO export committee on rabies， eighth report, Geneva WHO 1997 (WHO Technical Report Series,No.824)Annex2.

　　9，Meslin FX, Kaplan MM, Koprowski H. Laboratory techniques in rabies. Fourth edition, WHO, Geneva 1996,P7.

　　10，Fishbein DB, Yenne KM, Dreesen DW. Risk factors for systemic hypersensitivity reactions after booster vaccinations with human diploid cells rabies vaccine; A nation-wide prospective study. Vaccine,1993,11:1390-1394.

　　11，Suntharasamai P, Chaiprasithikul P, Wasi OA. Simplified and economic intradermal regimen of purified chick embryo cell rabies vaccine for postexposure prophylaxis. Vaccine,1994,12:508-512.

　　12，张云兰.狂犬疫苗致变态反应81例分析.济宁医学院学报，1995，18：68-69.

　　13，Scheiermann N, Baer J, Hilfenhaus J, et al. Reactogenicity and immunogenicite of the newly developed purified chick embryo cell(PCEC)-rabies vaccine in man. Zbl Bakt Hyg A, 1987, 265:439-450.

(收稿日期：1999-04-06)