脂质体介导的p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用

免疫学杂志 2000年第5期第16卷 基础免疫学

作者：穆红　刘丽　王玉亮　黄繁墙　刘蓉　彭林　刘明洲

单位：穆红（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）；刘丽（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）；王玉亮（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）；黄繁墙（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）；刘蓉（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）彭林（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）；刘明洲（天津第一中心医院检验中心，天津 300192）

关键词：脂质体；p53基因；肝癌细胞系

　　［摘 要］ 目的 观察外源野生型p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法 将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒p53-pcDNA₃，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2，用流式细胞仪检测p53-pcDNA₃对HepG2细胞生长的影响。结果 通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现，HepG2细胞生长受到明显的抑制。结论 脂质体介导的p53基因可在HepG2细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。

　　［中图分类号］ R735.7 ［文献标识码］ A

　　［文章编号］1000-8861（2000）05-0359-04

Inhibitory effects of lipofectamin-mediated p53 gene on the growth of liver cancer cells

MU Hong，LIU Li，WANG Yu-liang，HUANG Fan-qiang，LIU Rong，PENG Lin，LIU Ming-zhou

　　（Department of Laboratory，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）

　　［Abstract］ Objective To study the feasibility of the use of exogenous wild type p53 in gene therapy for liver cancer．Methods Recombinant eukaryotic expressing plasmid p53-pcDNA₃ containing human wild-type p53-cDNA was transiently introduced into human liver cancer cell line HepG2 mediated by cation iron lipofectamin and selected by G418．By flowcytometric analysis，the effects of p53-pcDNA₃ on the growth of liver cancer cells were evaluated．Results The cell growth curve，cell cycle，apoptosis index of HepG2（control cells） were compared with those of HepG2-p53 cells．The growth of HepG2-p53 cells was greatly suppressed．Conclusion Exogenous wild type p53 gene may stably exist in HepG2 cell after being mediated with lipofectamin．These results indicate that recombinant plasmid expressing wild type p53 may be useful for gene therapy of human liver cancer．

　　［Key words］ lipofectamin；p53 gene；liver cancer cell line

　　肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，在世界许多国家肝癌的发病均呈上升趋势，中国也是如此。80年代KNUDSON首先提出肿瘤抑癌基因的概念^［1］，与此同时，p53被发现。大量研究表明：p53基因在许多肿瘤中都有很高的突变率，是迄今为止发现的突变率最高、涉及范围最广的抑癌基因之一^［2］。我们用脂质体转染法，将含有外源性野生型p53基因的表达质粒转染肝癌细胞系，利用流式细胞技术观察外源性野生型p53基因对肝癌细胞恶性生长的抑制，通过上述研究已初步看到了p53基因在肝癌治疗中的应用潜力。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系和细胞培养　人肝癌细胞系HepG2由北京肿瘤研究所惠赠，生长培养基为含15％小牛血清的RPMI-1640，细胞在37 °C，5％ CO₂培养箱中培养。

　　1.2　p53-pcDNA₃表达质粒的构建　含1.8 kb　p53-cDNA的p53／HB101菌种由美国达拉斯医学中心惠赠。表达载体pcDNA₃／DH5a菌种由北京泌尿外科研究所惠赠。

　　1.2.1　pcDNA₃表达载体的组成：复制启始信号为来自猴空泡病毒的SV40，启动子为来自巨细胞病毒的PCMV，筛选标记为新霉素抗性基因Neo，该载体多克隆位点中含有合适的酶切位点，可进行定向克隆。

　　1.2.2　碱裂法提取p53与pcDNA₃质粒：挑取含有p53质粒的HB101菌种及含有pcDNA₃质粒的DH5a菌种，分别接种于含氨苄的LB液体培基中，扩增培养后用碱裂法分别提取p53与pcDNA₃质粒。

　　1.2.3　p53质粒与pcDNA₃质粒的酶切操作：使用EcoRⅠ分别对上述2种质粒进行酶切，然后用酚／氯仿抽提法对酶切产物进行纯化，再用XbaⅠ进行酶切，最后将双酶切产物切胶纯化获得1．8 kb　p53-cDNA和5．4 kb　pcDNA₃。

　　1.2.4　p53与pcDNA₃的连接：用T₄DNA连接酶将上述2种质粒连接起来，电泳观察重组质粒p53-pcDNA₃。

　　1.2.5　重组质粒p53-pcDNA₃转化大肠杆菌及鉴定：将连接产物转化感受态细菌扩增转化菌落，然后用碱裂法提取重组质粒。为了证明p53基因与pcDNA₃是正向连接，再用限制性内切酶EcoRⅠ、XbⅠ消化重组质粒p53-pcDNA₃，经电泳酶切图分析确定。

　　1.3　阳离子脂质体介导的基因转染　阳离子脂质体Lipofectamin购自Gibco公司。将HepG2细胞复苏并进行培养传代，然后测定HepG2细胞对G418的敏感性，选择最佳筛选浓度。将2 μg含p53-pcDNA₃的DNA和14 μl　Lipofectamin分别稀释于100 μl无血清培养基中。30　min后将2种溶液混合，置室温45 min。将Lipοfectamin-DNA混合物小心滴加至细胞上，轻轻混匀。培养5 h后更换完全培养基，待细胞密度达50％～70％融合后，弃掉培养基，更换含有300 μg／ml　G418的培养基继续培养。10 d后可见有抗性克隆形成，待其逐渐增大后，传代培养，被转染的细胞命名为HepG2-p53。

　　1.4　外源p53基因对人肿瘤细胞恶性生长的影响

　　1.4.1　生长曲线：向24孔板中分别接种细胞数约为1×10⁴的HepG2细胞和HepG2-p53细胞，置5％ CO₂中培养，从次日开始检测第一组（每组3孔）每个孔的细胞总数，取3个孔的平均值，如此至最后一组。采用上述数据绘制曲线图。

　　1.4.2　流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数：将HepG2和HepG2-p53细胞分别培养生长至80％接近汇合，用PBS漂洗细胞，用75％冷乙醇固定18 h以上，用400目筛网过滤细胞后进行流式细胞仪检测。

　　2　结果

　　2.1　细胞培养　HepG2细胞为梭型，贴壁生长，且易重叠。

　　2.2　重组质粒p53-pcDNA₃的构建　通过标准碱裂解法分别提取p53和pcDNA₃质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ，XbaⅠ分别消化上述2种质粒，得到1．8 kb的p53和5．4 kb的pcDNA₃（见图1，图2），然后用T₄DNA连接酶将已暴露酶切位点的2种质粒连接起来，得到重组质粒p53-pcDNA₃（见图3）。我们将重组质粒p53-pcDNA₃转化大肠杆菌，扩增后收获菌落，提取质粒，再用限制性内切酶EcoRⅠ，XbaⅠ消化上述质粒，经琼脂糖电泳证明p53正向连接于质粒pcDNA₃上。

图1双酶切后的p53和pcDNA₃

　　Fig　1Restriction　enzyme　digestion　of　p53　and　pcDNA₃

　　left　1～5：purified　p53　after　restriction　enzyme　digestion；right　1～5：

　　purified　pcDNA₃　after　restriction　enzyme　digestion

图2双酶切后切胶纯化

　　Fig　2Purify　after　restriction　enzyme　digestion

　　1，3：purified　pcDNA₃；5：λDNA／Hind　Ⅲ；6，7，8：purified　P53

　　2.3　转化细胞系的建立　将重组质粒p53-pcDNA₃转染HepG2细胞，经G418筛选2周后，镜下可见转化集落，命名为HepG2-p53细胞系。转染细胞HepG2-p53生长较慢，每间隔10 d左右可传代1次。转染细胞形态与未转染细胞相比未见明显改变。

图3p53和pcDNA₃的连接

　　Fig　3Connection　of　p53　and　pcDNA₃

　　1：double　restriction　enzyme　digestion　of　pcDNA₃；

　　2：λDNA／Hind　Ⅲ；3：p53＋pcDNA₃　without　ligase；

　　4：p53＋pcDNA₃　connection　products

　　2.4　HepG2-p53与HepG2恶性生长的比较

　　2.4.1　生长曲线：HepG2-p53细胞与HepG2细胞接种培养后，于2，4，6，8 d计数，转染的HepG2-p53细胞生长缓慢（见图4），说明HepG2-p53细胞的生长速率低于对照组HepG2细胞。

图4HepG2-p53和HepG2细胞生长曲线图，P＜0.05

　　Fig　4Growth　curves　of　HepG2-p53　and　HepG2　cell，P＜0.05

　　2.4.2　流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数：HepG2-p53细胞周期分布是G0＋G1＝53.64％，S＝31.35％，G2＋M＝15.01％，凋亡指数是51.93％。HepG2细胞周期分布是G0＋G1＝37.29％，S＝36.95％，G2＋M＝25.76％，凋亡指数是10.38％，P＜0.01。

　　3　讨论

　　野生型p53基因（wt-p53）是重要的抑癌基因之一，位于17号染色体短臂，编码53 kD核磷酸蛋白，该蛋白通过p21蛋白参与细胞周期的调控，阻止细胞从G1期进入S期，对细胞分裂及增殖起负调节作用^［3］。在内外致癌因素作用下，p53可发生突变，其功能丧失。突变的p53具有癌基因的特性，导致细胞生长失控^［4］。一些研究已显示：转染野生型p53表达质粒可使p53蛋白过度表达，由此直接引起细胞凋亡或抑制生长，最近一些体内外实验已初步证明了野生型p53基因在某些肿瘤治疗方面的潜力^［5］。

　　将外源p53基因介导于癌细胞，研究其对细胞恶性生长的影响，不仅可揭示p53基因的抑癌功能，而且为用p53治疗癌症提供了实验依据。该研究包括受体细胞培养，表达质粒的构建，基因转染的方法以及外源p53基因对癌细胞恶性生长的影响。本实验所用表达载体pcDNA₃含有合适的酶切位点，可进行定向克隆，表达载体中含有Neo抗性基因，利于用G418筛选，其启动子pCMV启动效果较好。我们用2个内切酶分别将p53和pcDNA₃进行酶切，使其分别暴露了2个不同的粘性末端，所以p53插入到载体中的方向只能有1种，且正好位于pCMV启动子下游，为正确转录方向。因此这种克隆也称定向克隆。

　　本实验选择阳离子脂质体为转染载体，通过细胞生长曲线和流式细胞仪检测细胞周期与凋亡指数来观察p53基因对HepG2细胞恶性生长的影响。从细胞的生长曲线可以看出，转染细胞HepG2-p53生长缓慢，而对照组细胞HepG2生长明显，保持了恶性生长的特点。野生型p53是细胞周期中由G1→S的关卡，可以使G1延长，并促进细胞的凋亡。通过流式细胞仪的检测，HepG2-p53细胞DNA合成期和静止期（G0＋G1）细胞比例高于对照组HepG2细胞，而DNA合成期（S），合成后期和分裂期（G2＋M）细胞比例降低。细胞的凋亡指数也由转染前的10.38％上升为51.93％。尽管基因调控机制尚不完全清楚，但结果证明外源野生型p53基因可抑制人肝癌细胞的恶性生长。

　　野生型p53用于基因治疗的研究在国际上已有较多的报道^［6～8］，但该方法不能彻底消灭肿瘤，这是由于肿瘤的发生是多基因、多阶段的，并非单一基因所致。就目前的理论和技术水平来看，对肿瘤实行多基因全方位的治疗还不能实现；而p53无疑是肿瘤发生的关键部分，其对肿瘤的治疗有很大的实际应用价值。

　　［基金项目］ 天津市卫生局科研课题资助项目（98KYGG-1）

　　［作者简介］ 穆 红（1966－），女，天津市人，主管技师，本科，主要从事分子生物学研究。

［参考文献］

　　［1］　　KNUDSON　AG　JR．Mutation　and　cancer：statistical

　　［收稿日期］ 1999-11-16； ［修回日期］ 2000-01-04