实验性大鼠肝癌变过程中p16和Rb基因表达的动态观察
临床与实验病理学杂志 1999年第3期第15卷 实验研究
作者：刘启福 罗丹 苏建家 段小娴 覃国忠 罗元 覃柳亮 李瑗
单位：刘启福 罗丹 苏建家 段小娴 覃国忠 罗元 覃柳亮 李瑗（广西肿瘤研究所，南宁 530021）
关键词：肝肿瘤；实验性；γ-谷氨酰转移酶；p16基因；Rb基因；大鼠
摘要 目的：动态观察实验大鼠肝癌发生的启动、促进、发展和癌形成的不同阶段中p16和Rb基因的表达状态及其与病理改变及γ-GT酶异常灶变化的关系。方法：采用Solt-Farber模型和免疫组化方法。结果：p16和Rb基因从促癌阶段的增生结节至癌形成阶段的肝癌组织均表达异常，与-GT酶的表达有一定的吻合性。结论：p16和Rb基因的表达异常与肝细胞癌变关系密切。两者在肝癌发生的早期即发生改变，且有相互协同的作用。
分类号 R735.7 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(1999)03-0227-03
The expressions of p16 and Rb gene during multiple chemical hepatocarcinogenesis in rats
Liu Qifu, Luo Dan, Su Jianjia et al
(Guangxi Cancer Institute, Nanning 530021)
ABSTRACT Purpose To investigate the relationship among the expression of p16 and Rb, the histologic alterations and -GT foci during initial, promotion, progression and neoplastic formation stages of chemical hepatocacinogenesis in rats. Methods Solt-Farber model and immunohistochemistry were used.Results The abnormal expressions of p16 and Rb genes were found from promotion stage to the liver cancer formation stage and correlated with the expression of -GT foci.Conclusion There is a close correlation between the abnormal expressions of p16, Rb gene and the malignant transformation of hepatocyte. These abnormalities were observed at the early stage of hepatocarcinogenesis. There might be a synergetic effect between p16 and Rb gene in hepatocarcinogenesis.
KEY WORDS liver neoplasms, experimental; gamma-glutamyltransferase; p16 gene; Rb gene; rats
近年来的研究表明，细胞周期调节失控是癌变的重要原因。抑癌基因p16和Rb分别编码的蛋白p16和pRb，都是细胞周期重要的调节因子，在细胞周期G1到S期中主要起负调节作用，以防止细胞增殖失控向肿瘤性增生转化。已经在人类多种肿瘤中发现p16和(或)Rb基因的突变或缺失。作者用免疫组化法动态观察在Solt-Farber模型实验大鼠肝癌发生的启动、促进、发展和癌形成的不同阶段中，p16和Rb基因的表达状态，及其与相应阶段的病理改变和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT酶)异常灶变化的关系。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立 6周龄♂Wistar大鼠55只，体重150～170 g，随机分实验组(A组，35只)与对照组(B组，20只)。实验组依据Solt-Farber模型〔1〕。步骤为：腹腔单剂量注射二乙基亚硝胺(DEN)，作为启动剂，剂量为200 mg。kg-1体重；2周后给含0.015%二乙酰氨基芴(2-AAF)的饲料，实验第3周末行肝2/3大部分切除术(PH)，继续喂含0.015% 2-AAF的饲料至第4周末，此为选择性促癌程序；换正常饲料观察至50周。对照组单剂量腹腔注射生理盐水，喂正常饲料。各组分别于第2、4、25、50周末处死动物，每组3～5只。取肝叶最大径处最大切面组织，厚3 mm，浸入4℃丙酮：95%乙醇(1∶1)液固定，低温石蜡包埋，切片4～5 μm。
1.2 肝脏病理形态学观察及γ-GT组化染色 按文献报道方法进行。用电脑图形扫描分析系统检测
-GT灶的平面及立体量化指标(个/cm2, mm2/cm2等)。
1.3 免疫组化 采用S-P法，兔抗p16、兔抗Rb多克隆抗体为美国Santa Cruz产品，S-P即用型试剂购自福州迈新生物技术公司。每次实验均设阳性对照和阴性对照。染色强度分为：浅棕色(+)，棕色(
)，深棕色(
)。
表1 DEN长期诱癌过程中不同阶段-GT灶发生情况(
±s)
| 组别 |
n |
个/cm2 |
mm/cm2 |
mm2/个 |
个/cm3 |
mm3/个 |
| A1 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| A2 |
5 |
27.0±15.0** |
4.25±2.20** |
0.15±0.07** |
550.8±364.5** |
0.08±0.06** |
| A3 |
5 |
39.6±9.7** |
29.63±11.88** |
0.85±0.49** |
548.8±377.1** |
0.84±0.62** |
| A4 |
8 |
21.0±6.4** |
42.47±9.19** |
2.27±1.10** |
190.7±101.9** |
2.93±2.08** |
| B1 |
3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
| B2 |
3 |
0.3±0.7 |
0.04±0.08 |
0.13±0.04 |
5.0±11.3 |
0.01±0.03 |
| B3 |
3 |
0.1±0.2 |
0.01±0.02 |
0.08±0.00 |
2.1±4.7 |
0.01±0.02 |
| B4 |
3 |
0.1±0.1 |
0.01±0.01 |
0.08±0.04 |
2.3±2.7 |
0.02±0.03 |
与相应B组比较，**P＜0.01
表2 p16和Rb基因在大鼠实验肝癌组各阶段异常表达的情况
| 组别 |
p16基因 |
组别 |
Rb基因 |
| 异常数/例数(%) |
组别 |
异常数/例数(%) |
异常数/例数(%) |
组别 |
异常数/例数(%) |
| A1 |
0/6 |
B1 |
0/5 |
A1 |
2/6(33.33) |
B1 |
1/4(25) |
| A2 |
5/5(100) |
B2 |
0/5 |
A2 |
6/6(100) |
B2 |
1/4(25) |
| A3 |
5/5(100) |
B3 |
0/5 |
A3 |
5/5(100) |
B3 |
2/5(40) |
| A4 |
7/7(100) |
B4 |
0/5 |
A4 |
5/6(83.33) |
B4 |
2/5(40) |
1.4 p16和pRb免疫组化染色结果判定标准〔2〕 ①整个癌组织的细胞核全部阳性者为正常表达。②所有癌细胞核阴性而癌旁细胞核阳性者，或癌内部分区域癌细胞核阴性者均判为异常表达。③整个癌组织及癌旁组织的细胞核均阴性或极弱阳性者，不予计数。④细胞浆阳性者不予考虑。数据经χ2检验处理。
2 结果
2.1 病理形态学改变 实验组：①诱癌阶段(A1组，予DEN 2周后)，肝脏眼观和镜观均无特殊改变。②促癌阶段(A2组，予PH及0.015% AAF 2周后)，肝表面及切面密布针尖至粟粒大小灰白或透明结节。镜下：多个变异肝细胞灶和结节，以嗜碱性细胞结节为多，并见卵圆细胞、间质细胞增生，多灶肝细胞坏死。③诱癌发展中期(A3组，实验第25周)，肝表面数个芝麻大小灰白或透明结节。镜下：以嗜酸性细胞结节为主，偶见透明细胞结节，出现早期大结节性肝硬变。④癌形成阶段(A4组，实验第50周，结束)，肝表面粗糙，多个大小不一灰白结节，最大者4 cm×3.5 cm×3 cm。镜下45%(8/18)大鼠有肝癌形成，主要为肝细胞癌，癌细胞呈团块状分布，较多较大的肝细胞增生灶(嗜酸或嗜碱或透明细胞组成)。对照组：无特殊改变。
2.2 γ-GT酶改变 各组在长期诱癌过程中各时期γ-GT发生情况见表1。实验组γ-GT灶出现于实验第4周末，即促癌程序结束后，随病变发展，γ-GT灶不断增大(平面和立体指标)，而灶的数目略减少。
2.3 免疫组化结果 p16和Rb基因在实验各阶段异常表达的情况见表2。实验组中p16和Rb基因的表达异常均见于增生结节和HCC组织内，对照组有少数几例也有Rb的改变。
3 讨论
实验性肝癌的发生，是在化学致癌物作用下，肝细胞被启动，继而出现肝细胞增生灶，增生结节(细胞群1→细胞群2……)，至肝细胞癌。本模型实验条件下，DEN单剂量给予作为启动剂，使一定数量肝细胞被致癌物启动，继而施与选择性促进程序。所用的2-AAF只抑制正常肝细胞的增生， 而被启动了的肝细胞不被2-AAF抑制，在肝切片迅速增生形成大量肝细胞增生性病变(包括增生灶和增生结节)，此模型将肝癌形成的启动和促进过程分开，有利于研究启动和促进的机制及影响因素。
不少文献〔3～6〕报道，与细胞周期启闭相关的调节因子除p16和Rb外，还有细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)以及细胞转录因子E2F等。
pRb是否磷酸化是Rb基因调节细胞生长的主要形式。在细胞周期G1期，pRb为去磷酸化状态，具活性，可与E2F结合，抑制E2F的转录活性，从而抑制DNA的合成，使细胞周期停滞在G1期。
对细胞增殖具有重要意义的是D1型cyclin，它与CDK4结合，活化CDK4。具活性的CDK 4促使pRb磷酸化(失活)，失去对E2F的抑制，E2F促使DNA合成，使细胞从G1期进入S期。
但p16可与cyclin D1竞争性与CDK4结合，从而抑制CDK4的活性，阻止或解除pRb的磷酸化，使pRb得以正常行使其停滞细胞周期在G1期的功能。因此，p16、pRb、cyclin D1、CDK4和E2F共同组成了一个对细胞周期的反馈调节系统，维持细胞分化生长的正常进行。
当p16基因和(或pRb基因表达异常时，细胞周期的负调节作用降低，细胞可无限制地从G1期进入S期，细胞增殖失控，可导致肿瘤发生。
在人类多种原发肿瘤及其转化细胞株中，均发现p16和Rb基因表达异常〔5〕。Okamoto等〔3〕报道，在29株来自人肺、食管、肝、结肠和胰腺等癌细胞株中，28株未检出p16和pRb的表达。
Kita等〔7〕在62例肝细胞癌和6株人肝癌细胞株中，发现3例肝细胞癌和1株肝癌细胞株p16基因有突变。
我们用免疫组织化学方法检测40例肝细胞癌及癌旁组织中p16和Rb基因的表达情况，发现p16和Rb基因异常表达分别为94.44%(34/36)和44.44%(16/36)，两者同时表达异常者占44.12%(15/34)(有另文发表)。
Taga等〔8〕用免疫组化检测115例非小细胞性肺癌，p16染色阴性31例，占27%，其生存期明显短于p16阳性者。认为p16的存在状态与预后关系密切，是很好的预测预后的指标，尤以在早期(Ⅰ～Ⅲ期)。
作者用免疫组化法动态观察大鼠肝癌模型不同发展阶段中p16和Rb基因的存在状态。结果显示，实验组从促癌阶段开始，经诱癌发展中期直到癌形成期，p16基因均出现表达异常，而对照组未见p16基因表达异常；Rb基因从诱癌阶段即开始有表达异常直至肝癌形成，但其对照组在不同阶段中也有一定数量的表达异常。
上述结果表明，从大鼠肝癌发生过程的早期阶段开始，p16和Rb基因即出现表达异常，表明两者的表达异常与肝癌的发生发展有关，并提示这两种抑癌基因(尤以p16基因为明显)的改变是肝癌形成中的早发事件，并持续到肝癌生成。
γ-GT酶是胚胎肝细胞合成的酶，成熟肝细胞则不表达。当肝细胞损伤致使肝细胞再生、癌变时，则γ-GT酶水平会重新升高。在实验性肝癌发生过程中，γ-GT酶的表达被认为是肝癌前病变的特征和标志〔9〕。
严瑞琪等〔10〕曾对肝癌短期实验中γ-GT酶异常灶与实验性肝癌发生的相关性进行了长期观察，发现早期γ-GT酶异常灶的发生与实验性肝癌的发生显著相关。本文p16和Rb基因的异常表达，从促癌阶段开始出现，并持续到肝癌生成，与γ-GT酶异常灶的改变相吻合，进一步提示两种抑癌基因的改变与肝癌生成有关。在实验性肝癌发生过程中，两者同时出现异常，表现为协同的作用。
基金项目：国家自然科学基金(No 39060032)资助课题
作者简介：刘启福，男，69岁，教授
参考文献
1，Solt D, Farber E. New principle for the analysis of chemical carcinogenesis. Nature,1976;263(5579):701～703
2，Cohen JA Geradts J. Loss of Rb and MTS1/CDKN2(p16) expression in huamn sarcomas. Human Pathol,1997;28(8):893～898
3，Okamoto A, Demetrik DJ, Spillare EA et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91(23):11045～11049
4，Li Y, Nichols MA, Shay JW et al. Transcriptional repression of the D-type cyclin dependent kinase inhibitor p16 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb. Cancer Res,1994;54(23): 6078～6082
5，Tam SW, Shay JW, Pagano M et al. Differential expression and cell cycle regulation of cyclin-dependent kinasw 4 inhibitor p16INK4. Cancer Res,1994;54(22):5816～5820
6，Ikeda MA, Jakoi L, Nevins JR et al. A unique role for the Rb protein in controlling E2F accumulation during cell growth and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(8):3215～3220
7，Kita R, Nishida N, Fukuda Y et al. Infrequent alterations of the p16INK4a gene in liver cancer. Int J Cancer,1996;62(2):176～180
8，Taga S, Osaki T, Ohgami A et al. Prognostic value of the immunohistochemical detection of p16INK4 expression in nonsmall cell lung carcinoma. Cancer, 1997;80(3):398～395
9，Peraino C, Staffeldt EF, Carnes BA et al. Characterization of histochemically detectable altered hepatocyte foci and their relationship to hepatic tumor igenesis in rats treated once with diethylnitrosamine or benzopyrene within one day after birth. Cancer Res, 1984;44(8):3340～3347
10，严瑞琪，覃国忠，陈志英等. 原发性肝癌的化学预防研究(1978～1995年). 中山医科大学学报，1996；17(增刊)：1～6
收稿日期：1998-06-08
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