顺铂和阿霉素诱导肝细胞肝癌细胞凋亡阈值研究
中国病理生理杂志 2000年第3期第16卷 论著
作者：钟雪云 陈运贤 孙晓东
单位：钟雪云（暨南大学医学院病理教研室，广东 广州 510632）；陈运贤（中山医科大学附属第一医院，广东 广州 510080）；孙晓东（浙江医科大学附属邵逸夫医院，浙江 杭州 310016）
关键词：阿霉素；顺铂；肝细胞瘤
［摘 要］ 目的：了解抗癌药物顺铂（CDDP）、阿霉素（ADM）诱导肝细胞肝癌 (HCC)的细胞凋亡阈值。方法：采用肿瘤细胞原代培养技术、活细胞萤光染色法和流式细胞仪定量分析。结果：顺铂或阿霉素与细胞共同培养后，荧光显微镜下见正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核内颗粒状荧光。随抗癌药物（ADM、CDDP）剂量的增加，诱导人肝癌细胞的细胞凋亡率也增加，但以ADM 1.0μg/mL和2.0μg/mL及CDDP 1.5μg/mL和3.0μg/mL作用明显。ADM 2.0 μg/mL可导致HCC细胞凋亡75%，CDDP 3.0μg/mL 可致HCC细胞凋亡75%。25例未经治疗的HCC细胞和Hep G-2细胞的ADM、CDDP敏感性检测表明，ADM的凋亡阈值为1.0μg/mL，CDDP的凋亡阈值为1.5μg/mL。临床凋亡敏感剂量分别为ADM 20 mg/m2,CDDP 30 mg/m2 。结论：本文获得的ADM和CDDP诱导HCC细胞凋亡的临床阈值对临床肿瘤化疗有一定的指导意义。
［中图分类号］ R735.7 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)03-0199-04
Study of apoptotic thershold of cis-diamminedichloroplatinum and adriamycin on hepatocellular carcinoma
ZHONG Xue-yun
( Department of Pathology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)
CHEN Yun-xian
(First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou)
SUN Xiao-dong
(Affiliated Sir Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou)
［Abstract］ AIM：To study the thershold of hepatocellular carcinoma (HCC) apoptosis induced by adriamycin (ADM) and cis-diamminedichloroplatinum(CDDP).METHODS: Using primary human hepatocellular carcinoma culture, immunofluorescence staining of Hoechst 33 258 in HCC cells ,and flow cytometric assay.RESULTS:24 h after HCC cells were cultured with ADM or CDDP, it were found there were dispersive fluorescences in normal cells nuclei, and compact particulate fluorescences in apoptosis cells nuclei by immunofluorescence staiming of Hoechst 33 258. The rate of HCC cells apoptosis was dependent on doses of ADM and CDDP. HCC cells apoptotic threshold were determined, i.e.ADM was 1.0 μg/mL and CDDP was 1.5μg/mL (The clinical apoptotic sensitive dosages were ADM 20 mg/m2 and CDDP 30 mg/m2.CONCLUSION: HCC cells apototic threshold of ADM and CDDP were efficient in clinical chemotherapy.
［MeSH］ Doxorubicin; Cisplatin; Hepatoma
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中居第2位。本病起病隐匿，病情发展迅速，临床诊断时多为中晚期。因此化学药物治疗仍是其重要的治疗手段之一。但是由于患者自身的多药耐药(multidrug resistance, MDR)以及化疗药物的毒副作用，其疗效欠佳。近年来发现许多抗癌药物(如5-Fu、阿霉素、顺铂，长春新碱等)能通过细胞凋亡的途径杀死肿瘤细胞［1，2］。为了解抗癌药物诱导肝细胞的凋亡阈值，给临床的优化治疗提供实验依据，我们采用原代肝癌细胞培养技术，观察抗癌药物顺铂(cis-diamminedic-
hloroplatinum,CDDP)、阿霉素（adriamycin, ADM）诱导肝癌细胞凋亡的最小剂量(即凋亡阈值)。
材 料 和 方 法
一、标本来源
（一）25例肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)标本取自暨南大学第一附属医院和中山医科大学附属肿瘤医院原发性肝细胞肝癌手术病人的手术切除肿瘤组织，术前患者均未经化疗，术后经病理检查证实。
（二）人肝癌细胞株Hep G-2由暨南大学病理教研室提供。
二、实验方法
（一）取材与处理 病人的手术标本切下后，立即剪取未坏死的肝癌组织，部分标本置于含青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液内，4℃保存，4 h内制备单细胞悬液；部分标本立即冰冻切片（厚度5μm），用免疫细胞化学染色法检测MDR的P-糖蛋白（P-glycoprotein ,P-gp）。
（二）HCC单细胞悬液制备 按文献及我们的改良方法制备HCC单细胞悬液［3～5］。
用眼科剪刀剪除标本的结缔组织，将标本剪成小块，用注射器活柄压碎，加入0.05%的胰蛋白酶，4℃消化6～8 h。当组织块外观呈粘稠状时加入适量的Hanks液，用吸管反复吹打,4层纱布过滤，离心、洗涤后用RPMI 1640培养液重新悬浮成单细胞悬液。
（三）ADM、CDDP诱导HCC细胞凋亡［4］ 用含10%胎牛血清的RPMI 1640液将HCC单细胞悬液和Hep G-2细胞株细胞浓度调整至106/mL，两种细胞悬液均分为6组(A、B、C、D、E、F)，37℃、 5%CO2浓度，二氧化碳培养箱培养。细胞接种24 h后加入不同浓度的ADM、CDDP，使ADM的浓度为A组0μg/mL，B组0.125μg/mL，C组0.25μg/mL，D组0.5μg/mL，E组1.0μg / mL ，F组2.0μg/mL；CDDP的终浓度为A组0μg/mL，B组0.1875μg/mL，C组0.375μg/mL，D组0.75μg/mL，E组1.5μg/mL，F组3.0μg/mL。继续培养24 h，常规胰酶消化，PBS洗涤1次，调整细胞浓度为106/mL，行活细胞荧光染色和流式细胞仪PI染色，检测细胞凋亡情况。
（四） 活细胞荧光染色法［5］ 加Hoechst 33 258 (Sigma 公司产品)入单细胞悬液，终浓度为1μg/mL，避光染色15 min，滴片后在荧光显微镜下观察细胞核DNA荧光。
（五）流式细胞仪碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色法［6］ 70%乙醇、4℃固定细胞悬液过夜；离心去除上清，细胞重悬在0.4 mL的PBS中，加10μL 5 mg/mL RNase A(Sigma公司产品)，37℃处理1 h；然后加50μL的溴化丙啶染色液(PI,1 mg/mL, Sigma 公司产品) ，4℃染色过夜。流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G１期DNA含量细胞为凋亡细胞。
（六）HCC的P-gp检测 冰冻切片的HCC标本稍凉干后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS（pH 7.20）冲洗，0.5% H2O2-甲醛浸泡消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗后用马血清孵育10 min，滴加抗P-gp单克隆抗体，37℃孵育1 h，PBS冲洗，加生物素-亲和素-过氧化物酶复合物（ABC），再次37℃孵育1 h，PBS冲洗，DAB显色，光学显微镜下观察500个细胞。胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒着色为阳性，未着色为阴性。
三、统计学处理
数据以
±s表示，显著性检验用χ2分析。
结 果
一、抗癌药物(ADM、CDDP)诱导人肝癌细胞的细胞凋亡结果
(一)活性细胞荧光染色检测结果 在荧光显微镜下，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核内见浓度改染的颗粒状荧光(图1)。计算500个细胞的细胞凋亡率。结果表明，随抗癌药物(ADM、CDDP)剂量的增加，肝癌细胞核DNA呈颗粒状染色的比例也增加，但以E组和F组作用明显，结果见图2、3。
（二）流式细胞仪检测结果 用流式细胞仪定量检测低于G1期细胞(凋亡细胞)，DNA直方图上出现二倍体峰减少(G1细胞)，G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型(亚G1峰)，而在光散射图谱上，出现低于正常的前向散射和较高的侧射。结果表明，ADM（2.0μg/mL）和CDDP（3.0μg/mL）可致HCC细胞亚二倍细胞群高达75%，见图4。
Fig 1 Immunoflourescence staining of Hoechst 33258 24 h after ADM administered in HCC cells(×500)
→:dispersive fluorescences in normal cells nuclei
△:compact particulate fluorescences in apoptosis cell nuclei
1 ADM作用HCC细胞24 h后，Hoechst 33258染色
Fig 2 Comparison of different doses of ADM on numbers of
HCC cell apotosis (±s,n=6)
2 不同剂量ADM诱导HCC细胞凋亡的比较
Fig 3 Comparison of different doses of CDDP on numbers
of HCC cell apotosis (±s,n=6)
3 不同剂量CDDP诱导HCC细胞凋亡的比较
Fig 4 Apoptosis of HCC cells by ADM and CDDP
4 ADM和CDDP诱导HCC细胞凋亡
二、25例肝癌手术标本中有18例进行P-gp检测，阳性率为72%（13/18）。
三、对25例未经治疗的原代培养原发性肝细胞肝癌细胞及HepG-2细胞株细胞的ADM、CDDP敏感性检测结果发现，E组、F组与A组对比有显著差异(P＜0.05)。经χ2检验分析，ADM的凋亡阈值为 1.0μg/mL，CDDP的凋亡阈值为1.5μg/mL（即E组浓度）。
四、根据药物浓度计算公式计算ADM和CDDP作用于HCC的临床敏感剂量
药物浓度(μg/mL)=［(药物mg×体表面积)/体重］×(100/60)
根据以上公式计算结果，ADM和CDDP作用于HCC的临床凋亡敏感剂量分别为 ADM 20 mg/m2、CDDP 30 mg/m2。
讨 论
临床上所用的抗癌药物，毒副作用非常大，且剂量越大，其副作用也越大。许多病人由于这种毒副作用的影响而被迫减少用药剂量或停药，导致化疗的失败。另外许多肿瘤患者自身存在着MDR基因。本研究病人有18例进行P-gp检测，其阳性率高达72%(13/18)，结果提示MDR是肝癌化疗治疗失败及复发的另一主要原因。
国内外许多实验室诱导产生肿瘤耐药株的过程中发现，建株时如果首先用低浓度的抗癌药物作用于肿瘤细胞，那么药物浓度递增越快，耐药产生时间越短（最短的时间为4周）；药物浓度递增越慢，耐药性产生时间越长（最长的为9个月，平均为4～6个月）［7，8］。这说明药物浓度与肿瘤MDR的产生相关，即抗癌药物剂量越大，越易于产生耐药性，并且耐药产生的时间短。故为了降低MDR的产生和药物毒副作用对机体的损害，应减少抗癌药物的剂量。但是小剂量用药不能有效地杀灭肿瘤细胞，最终导致患者因达不到治疗效果而死亡。为了解决这一矛盾,许多学者都在探讨优化肿瘤治疗以及多药耐药的逆转方法。近年来，采用局部化疗和动脉插管为代表的介入治疗，可使进入肿瘤区的抗癌药物浓度较外周血高4～22倍，从而提高疗效，减轻全身不良反应及其多药耐药的抗药性。但是，其结果仍不尽人意。
化疗是肿瘤治疗必不可缺的手段之一。研究表明，化学抗癌药物主要通过诱导癌细胞的凋亡达到治疗的目的［1，2］。根据抗癌药物的作用机制，寻求其达到杀死肿瘤细胞的凋亡阈值来指导临床用药，可能更为合理。本研究目的为寻找化疗药物诱导肝癌细胞的凋亡阈值，为临床用药提供优化治疗的依据。本实验结果表明ADM和CDDP诱导肝癌细胞的凋亡阈值分别为1.0μg/mL、1.5μg/mL。根据所采用的药物浓度计算公式推知，ADM和CDDP诱导细胞凋亡的临床剂量分别为20 mg/m2 和30 mg/m2。
细胞凋亡可能对抗癌药物的剂量学产生深远的意义，探讨药物达到杀死肿瘤细胞的凋亡阈值较盲目的大剂量用药更合理。
［基金项目］ 广东省科委重点攻关项目基金和广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”重点项目基金资助
［参 考 文 献］
［1］ Jiang S, Song mJ, Shin EC, et al. Apoptosis in human hepatoma cell lines by chemotherapeutic drugs via fas-dependent and Fas-independent pathways ［J］. Hepatology, 1999, 29(1):101～110.
［2］ Huang M,Lin G.The study of innate drug resistance of human hepatocellular carcinoma Be17402 cell line ［J］. Cancer Lett, 1999,135(1):97～105.
［3］ 孙晓东，钟雪云. 原发性肝癌细胞原代培养制备过程中细胞分离方法的改良 ［J］.中国病理生理杂志，1998, 10(6):767～769.
［4］ 姚良权，新生，周清平，等. 原代肝癌干细胞快速化疗药物敏感试验 ［J］. 中华实验外科杂志，1993, 10:113～114.
［5］ 姜泊，张亚历，周殿元. 分子生物学常用实验方法［M］. 第1版. 北京：人民卫生出版社,1996.170～183.
［6］ 鱼达，杨骅. 细胞凋亡的研究进展［J］. 实用肿瘤杂志, 1996, 11:95～96.
［7］ Davey RA, Longhurst TJ, Davey MW, et al. Drug resistance mechanisms and MPR expression in response to epirubicin treatment in a human leukemia cell line ［J］. Leukemia Res，1995，19:275～282.
［8］ Takeda Y, Nishio K, Niitani H, et al. Reversal of multidrug resistance by tyrosine-kinase inhibitors in a non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line. Int J Cancer,1994,57:229～239.
［收稿日期］1999-10-13 ［修回日期］2000-02-02
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