非那西丁在二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠的代谢

　　中国药理学通报2000年第16卷第2期

　　崔贞福　张国庆　罗明　王华梁　王健　阎振林　贺平　钱其军　吴孟超　郭亚军

　　摘　要　目的　①研究非那西丁在二乙基亚硝胺（DEN）诱发肝癌大鼠中的代谢，以及其它评估肝脏功能指标的改变；②血浆结合型代谢产物含量改变对非那西丁试验的影响。方法　饮用DEN诱发大鼠肝癌，观察血液非那西丁及利多卡因代谢产物，白蛋白和胆红素含量，凝血酶原时间的改变；采用HPLC法测定血浆中非那西丁结合型和游离型代谢产物含量。结果　与正常对照组相比，DEN组大鼠肝脏出现多发性癌结节，肝/体重比增加3.3倍，血浆谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶含量明显升高，但凝血酶原时间、血浆白蛋白、非那西丁和利多卡因代谢产物含量无明显改变。DEN组大鼠血浆非那西丁游离型代谢产物含量高于正常对照组43.9%（P＜0.01），但结合型＋游离型代谢产物总量无明显差别。结论　在DEN诱发肝癌大鼠，肝细胞严重受损，肝脏体积增大，非那西丁代谢等肝功能试验无明显改变。同时测定游离型及结合型代谢产物含量，才能正确反映肝脏的生物转化功能。

　　关键词：二乙基亚硝胺　肝癌　非那西丁试验　利多卡因试验　大鼠

　　在体内，非那西丁经肝微粒体P450ⅠA₂酶催化，氮位去乙基，形成对氨基乙酚（Ace）。口服或静脉注射非那西丁后，测定血液中对氨基乙酚含量，可反映肝细胞的功能状态。所以，非那西丁试验作为评估肝脏功能的指标，或研究肝P450ⅠA₂酶活性的模型药物，备受推崇^［1］。但是，肝脏的功能十分复杂，并受多种因素影响，临床及动物实验经常发现，肝细胞已严重受损，但功能试验正常。值得注意的是，以往关于非那西丁、利多卡因等肝功能试验的评价，大部分都采用急性肝损害模型，而且，只测定血液中游离型代谢产物含量。本文用二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌及肝损害，旨在研究肝细胞受损，但肝脏体积明显增大时，非那西丁代谢等肝功能试验有无改变，以及血浆中结合型代谢产物含量变化对非那西丁试验的影响。

　　1　材料

　　1.1　试剂　非那西丁，DEN，葡萄糖醛酸-硫酸酶，购于Sigma公司；对氨基乙酚，购于Aldrich公司；利多卡因，上海朝晖制药厂生产，批号：9802022；HPLC用甲醇，上海陆都实业有限公司生产，批号：96080518；单乙基甘氨酰二甲苯（MEGX）试剂盒，购于美国Abbott公司；肝功能检测试剂盒，分别购于日本第一化学株式会社、德国宝灵曼公司和上海荣盛公司；其余试剂均为国产分析纯或优级纯。

　　1.2　仪器　Beckman高效液相色谱系统（125型泵，168型UV-检测器，ODS_c18柱4.6×250　mm，GOLD软件），美国Beckman公司制造。荧光偏振免疫分析仪，美国Abbott公司制造。7170A型自动生化分析仪，日本岛津公司制造。

　　1.3　实验动物　Wistar大鼠，♂，体重（75.2±7.2）　g，由中科院上海实验动物中心提供，清洁级，证书号005。所有大鼠分笼饲养，采用标准化光照及饮食，适应期1 wk，取血前12 h开始禁食。

　　2　方法

　　2.1　DEN诱发肝癌大鼠非那西丁代谢及其它肝功能试验的改变　60只大鼠，随机分成4组，每组15只。A组和B组为模型组，按文献报道方法^［2］，略加改进，在饮水中加入DEN，前50 d浓度为0.06 g*L^-1，后40 d为0.08 g*L^-1，自由饮用。C组和D组为正常对照，饮水中不加DEN。连续诱导90 d停DEN，再正常饲养40 d。A组与C组大鼠尾静脉注射6 g*L^-1非那西丁20 mg*kg^-1，间隔30 min后，断头取血。B组与D组大鼠尾静脉注射1 g*L^-1利多卡因2 mg*kg^-1，15 min后，断头取血，血液分别置于含枸椽酸钠的抗凝管和非抗凝管内。解剖肝脏，沾除血渍。计数肝表面肿瘤结节数后，称肝重，计算肝/体重比，统一取右叶肝组织，福尔马林液固定，石腊包埋，制备成厚5　μm的切片，HE染色，常规组织学检查。采用高效液相色谱法^［3，4］，测定血浆非那西丁游离型及结合型代谢产物含量，用荧光偏振免疫分析法和自动生化分析仪，测定血液利多卡因代谢产物（MEGX）含量及白蛋白（ALB）谷丙转氨酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、胆红素（BIL）、碱性磷酸酶（ALP）含量。

Tab 1　Incidence of hepatoma induced with DEN and liver/body weight in rats(X±s,n=30)

　　^**P＜0.01 vs normal control

Tab 2　Changes of plasma aLB,BIL,ALT,ALP,γ-GT and TT in rats with DEN-induced hepatoma (X±s,n=30)

　　^**P＜0.01 vs normal control

Tab 3　Metabolism of phenacetin and lidocaine in rats with DEN-induced hepatoma(X±s,n=15)

　　^*P＜0.05,^**P＜0.01 vs normal control2.2　统计学处理　所有定量资料均采用X±s表示，两组间差异用分组t检验，进行显著性检验。两组间率的差异用χ²检验，进行显著性检验。

　　3　结果

　　30只大鼠饮用DEN 130 d后，肝脏出现多发性粟粒样结节，部分呈巨块状，肝癌发生率为100％。肝/体重比比正常对照组增加3.3倍。肿瘤结节组织学检查显示癌巢、腺瘤样变，癌旁组织呈空泡样变性，伴充血、水肿和灶性坏死。对照组大鼠无一只出现自发性肝癌，肝组织切片检查未见明显异常(表1)。由表2，3可以看出，DEN组大鼠ALT、γ-GT和ALP等反映细胞损伤的指标明显升高（P＜0.01）；除胆红素外，血浆白蛋白、凝血酶原时间（TT）、MTGX和非那西丁代谢产物Ace含量等反映肝脏功能的指标均无明显改变。DEN组大鼠血浆游离型Ace含量高于正常对照组43.9%(P＜0.01),但结合型Ace加游离型Ace的总量无明显差别。

　　4　讨论

　　实验结果表明，在DEN诱发肝癌的大鼠，其肝脏出现弥漫性粟粒样结节，部分形成巨块状。组织学检查，除癌巢、腺瘤样变外，同时还伴有空泡状变性、灶性坏死等慢性非特异性肝细胞损害。另外，肝脏体积增大，肝/体重比高于正常对照组3.3倍。血液ALT、γ-GT和ALP含量明显升高。由此不难看出，DEN引起的大鼠肝脏损害，至少包括3个方面，①诱发肝癌；②肝细胞严重损伤；③肝细胞增殖，肝脏体积增大。

　　令我们始料不及的是，虽然DEN诱发肝癌大鼠的肝细胞严重受损，但血浆白蛋白含量、凝血酶原时间、非那西丁试验和利多卡因试验均无明显改变。如果只测定血浆游离型非那西丁代谢产物含量，结论反而是DEN诱发肝癌大鼠肝脏的生物转化功能优于正常对照大鼠。实际上，肝脏的生物转化功能由一相反应和二相反应所组成。前者包括氧化，还原和水解代谢，后者为结合代谢。绝大多数外源性化学物质进入机体后，首先进行一相反应，然后通过二相反应，与葡萄糖醛酸或硫酸结合，经肾脏和胆道排出体外。因此，体内代谢产物通常以游离型和结合型两种方式存在。游离型代谢产物含量除与P450氧化酶活性有关外，还受结合酶活性影响。肝细胞损伤时，结合代谢酶活性降低，势必影响游离型代谢产物含量。在我们的实验中，DEN组大鼠血浆非那西丁代谢产物总量与正常对照组并无明显差别，但由于结合型Ace含量比正常对照组减少20.3%,造成游离型Ace含量相对升高。如按常规方法，只测定游离离型Ace含量，则会作出DEN大鼠肝脏生物转化功能增强的错误结论。

　　利多卡因试验类似于非那西丁试验。其原理是，利多卡因被静脉注射后，经肝P4503A酶特异性代谢,形成MEGX。所以，测定血液中MEGX含量，可反映肝脏的生物转化功能。近年来，利多卡因试验被广泛用于临床和药理学实验，尤其是肝移植手术，用其评估供肝的功能状态。在我们的实验中，DEN组大鼠MEGX含量不但不降低，反而高于正常对照组大鼠10.4%。其是否也与结合型代谢产物含量改变有关，本文不能作出结论。另外，我们注意到，最近有不少作者也报道^［6，7］，利多卡因试验不能真实反映慢性肝病患者的肝脏损伤情况。在此，我们呼吁临床及药理学工作者，做肝脏生物转化功能试验时，不宜只测定游离型代谢产物含量。

　　血浆白蛋白含量和凝血酶原时间主要与肝脏蛋白合成功能有关，也是临床评估肝脏功能的重要指标。在DEN诱发肝癌的大鼠，血浆白蛋白含量、凝血酶原时间、非那西丁试验和利多卡因试验均无明显改变。理论上，正常肝脏动用1/4的功能，就能维持机体新陈代谢的需要，剩余的3/4功能被称之为肝脏储备功能。患肝脏疾病时，如果动用了肝脏储备功能后，仍不能维持机体代谢的需要，肝细胞则大量增生，肝脏体积增大、发挥代偿功能。在我们的实验中，DEN组大鼠肝脏体积明显增大，肝/体重比高于正常对照组3.3倍，从而维持了肝脏功能的相对正常。显然，做肝功能检查时，最好同时采用B型超声或CT等物理学方法，从形态和功能两个方面进行综合分析判断。

　　作者简介：崔贞福，女，44岁，副研究员；吴孟超，男，教授，中科院院士崔贞福（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　罗明（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　阎振林（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　贺平（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　钱其军（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　吴孟超（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　郭亚军（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因治疗中心，上海　200438)

　　张国庆（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因药械科，上海　200438)

　　王华梁（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因检验科，上海　200438)

　　王健（第二军医大学东方肝胆外科医院肿瘤免疫基因检验科，上海　200438）

　　参考文献

　　1．Chae YH, Yun CH, Guenerich fP el al. Role of human hepatic and pulmonary cytochrime P450 enzymes in the metabolism of the environmental carcinogen 6-nitrochrysene.　Cancer Res，1993;53(29):2028～32

　　2．陈树军，张玉砚，许凯黎et al.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中血清甲胎蛋白分子变异体动态变化.肿瘤，1989；9(11):17～9

　　3．Chen LS, Sandrsa NM, Chreng SY. Decrease of plasma and urinary oxidativemetabolites of acetaminohpen after consumption of watercress by human volunteers. Clin Pharm Ther, 1996;60(2):651～60

　　4．Robert MN, Lewisstein BA, Thomas P, Elliot ST. Sources of interindividual variations in acetaminophen and antipyrine metabolism. Clin Pharm Ther,1984;36(1):417～30

　　5．陈世耀，王吉耀.利多卡因试验在肝移植中的应用及其在慢性肝病诊断及预后评价中的应用前景.临床肝胆病杂志， 1996；12（3）；128～30

　　6．Elin RJ, Fried MW, Sampson M et al. Assessment of minoethylghycinexy-lidide as measure of liver function for patients with chronic viral hepatitis. Clin　Chem，1997;43(10):1952～7