转化生长因子β1诱发人肝癌细胞凋亡的形态学研究

卫生毒理学杂志 1999年第1期第13卷 论著

作者：周菁　徐锡坤　王心如　周建伟　邱清　徐昌芬

单位：南京医科大学公共卫生学院劳卫教研室(210029)

关键词：重组人转化生长因子β1　肝癌细胞　细胞凋亡

　　内容摘要　为了进一步研究rh TGF-β₁抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用机理，应用光镜、电镜观察rh TGF-β₁抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的形态学改变。结果显示：经rh TGF-β₁10ng/ml作用96小时后，SMMC-7721细胞出现曲型的凋亡形态。相差显微镜下表现为细胞变圆、体积缩小；HE染色可见核固缩；荧光显微镜观察凋亡细胞多为核亮染呈致密斑块；电镜下可见由膜包裹内容物的凋亡小体。结果证实：rh TGF-β₁具有诱发肝癌人细胞SMMC-7721凋亡的作用。

Morphological research of apoptosis in human hepatoma cell line SMMC-7721 induced by rhTGF-β₁

Zhou jing　Xu Xi-kun　Wang Xing-ru　et al

　　(School of Public Health Nanjing Medical University,Nanjing　210029)

　　Our research was done to study the mechanism of inhibiting proliferation by rhTGF-β₁ in Human Hepatoma cell line SMMC-7721.The effect induced by rhTGF-β₁ in SMMC-7721 cells was observed under light microscope,electron microscope.The results showed that 96 hours after the induction of SMMC-7 721 cells by rhTGF-β₁ at 10ng/ml the typical apoptosis morphological changes were observed.These changes included that cells turned round and shrinkaged,the chromatin condensed and membrane-bound apoptosis bodies could be seen.The findings of the present study demonstrate that rhTGF-β₁ can induce apoptosis in SMMC-7 721 celss.

　　Key words:Transforming growth factor β₁;Human Hepatom cell line;Apoptosis

　　转化生长因子(transforming growth factor β₁)是具有双功能的多肽，它具有诱导间质细胞的生长，又可抑制多数表皮细胞的生长。已有研究报道TGF-β₁对部分肿瘤有抑制作用^［1～3］，我们以SMMC-7721细胞进行了rh TGF-β₁诱发人肝癌细胞凋亡的形态学研究。

　　材料与方法

　　1.主要试剂：重组人转化生长因子β₁(rhTGF-β₁)和RPMI 1640分别购自美国GALBIOCHEM和GIBCO公司；小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，用前经56℃30分灭活；吖啶橙(AO)和溴乙锭(EB)为FLUKA公司产品。

　　2.仪器：CO₂培养箱为美国OUENE公司产品，型号DWJ700SW；倒置相差显微镜为日本OLYMPUS CK型；荧光显微镜为OLYMPUS BHF型；透射电镜为荷兰菲力浦公司产品，型号为PHILIPS EM 2400。

　　3.SMMC-7721细胞(上海生物细胞所提供)用RPMI1640培养液(含10%小牛血清，pH7.2)调整浓度为8×10⁴个/ml接种于放有小盖片的培养瓶中，置37℃、5%CO₂孵箱培养，24小时后细胞贴壁良好时，换液，对照组加无血清的培养液，实验组加含终浓度为10ng/ml rh TGF-β₁的无血清培养液，两组细胞培养48小时和96小时后，分别于倒置相差显微镜下观察拍照后，小盖片从培养瓶中取出做HE染色。

　　4.荧光染色^［4］：用0.02%EDTA消化收集培养48小时后的对照组和实验组细胞，制成浓度为10⁶个/ml的细胞悬液，用AO/EB(100μg/ml)作荧光染色，于荧光显微镜下观察细胞形态变化。每个剂量组观察300个细胞、分别计数正常细胞数(核染色质结构正常，胞膜完整，着均匀的绿色)、早期凋亡细胞数(核染亮绿色呈致密斑块或碎片状)、晚期凋亡细胞数(核染橘红色呈致密斑块或碎片状)、坏死细胞数(胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色)，并计算各率。

　　5.电镜观察：两组细胞培养96小时后用EDTA消化收集，PBS洗2遍，2.5%戊二醛及1%锇酸固定，醛酸铀染色，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，LKB超薄切片机切片，在PHILIPS电镜下观察。

　　结　　果

　　1.倒置相差显微镜观察：对照组细胞贴壁生长良好，边界清楚，呈上皮样细胞形态，可见较多的核分裂相。rh TGF-β₁ 10ng/ml作用48小时，部分细胞变圆，体积缩小，但胞膜完整漂于培养液中，rh TGF-β₁ 10ng/ml作用96小时，可见更多的细胞漂于培养液中，有的细胞崩解为碎片(图1)。

图1　倒置相差显微镜下SMMC-7721细胞形态。A，对照组；B，10ng/ml rh TGFβ₁作用48h时的形态；C,10ng/ml rh TGFβ₁作用96h时形态(×200)

　　2.HE染色光镜观察：对照组细胞核位于细胞中央，核膜轮廓清晰，核仁明显，染色质疏松，处理组细胞核固缩成团状块(图2)。

图2　SMMC-7721细胞HE染色。A，对照组；B，凋亡细胞核固缩(↑)(×400)

　　3.荧光显微镜观察：对照组在培养48小时后，大多数细胞(＞95%)呈正常细胞形态；细胞经2.5ng/ml rh TGF-β₁作用48小时后，有7.7%的细胞呈现早期凋亡的形态，有2.6%的细胞呈现晚期凋亡细胞的形态；随着剂量增大，凋亡细胞数增加，坏死细胞数也有所增加(图3和附表)。

附表　rh TGF-β₁作用48小时对SMMC-7721细胞的影响

EA：早期凋亡细胞　LA：晚期凋亡细胞

　　N：坏死细胞　与对照组相比　**P＜0.01

图3　SMMC-7721细胞荧光染色。A，正常细胞染色质结构正常染均匀的绿色(a)；早期凋亡细胞核染亮绿色呈致密斑块(b)(×200)；B，晚期凋亡细胞核染橘红色呈致密斑块(a)；早期凋亡细胞(b)(×400)；C，凋亡细胞核呈碎片状(×950)；D，坏死细胞核膜完整，染均匀的红色(×400)

　　4.电镜观察：对照组细胞表面有丰富的微绒毛、胞浆适量、各细胞器清楚、核膜完整、核染色质电子密度低、核仁较大、一般为2～3个；实验组经rh TGF-β₁10ng/ml诱导96小时后，细胞体积缩小，多数细胞微绒毛消失，胞质密度增高，胞浆中内质网和线粒体等细胞器尚正常，核染色质电子密度增高固缩成几个团块状，可见到由胞膜包裹着的浓缩的染色质片段形成的凋亡小体，有的凋亡小体带蒂与细胞相连(图4)。

图4　SMMC-7721细胞的超微结构。A，对照组；B，凋亡细胞：膜包裹内容物的凋亡小体带蒂与细胞相连(×10500)

　　讨　　论

　　TGF-β₁是许多人和动物的多种类型上皮细胞生长的负性调节因子，一些研究表明TGF-β₁抑制肿瘤细胞生长是通过诱导癌细胞凋亡和改变癌蛋白的表达而实现的^［5,6］。细胞凋亡是不同于坏死的死亡方式，坏死是外界损伤因素直接破坏细胞的生物膜和能量代谢，导致细胞生命活动的被动性中断，坏死时没有新的基因表达和蛋白质合成；凋亡是细胞主动参与的自杀性死亡，往往需要新基因转录和蛋白质合成。细胞凋亡的现象为肿瘤的治疗提供了新的思路。

　　rh TGF-β₁对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用的一些定量指标。本实验通过形态学观察进一步表明：rh TGF-β₁对SMMC-7721细胞有增殖抑制作用、死亡细胞大部分呈现典型的凋亡细胞形态特征：核染色质固缩成几个高电子密度的块状聚集物；细胞质浓缩，常伴有细胞膜和核膜的皱曲，胞质内出现半透明小泡；晚期核常断裂，形成位于核膜下的片段，最后细胞向外突出的部分与细胞分离，形成数量不等的凋亡小体。这些形态学改变说明rh TGF-β₁对SMMC-7721细胞增殖抑制作用是由于激发了SMMC-7721细胞的凋亡，rh TGF-β₁诱发SMMC-7721细胞凋亡的机理有待于进一步研究。

　　(本实验承南京医科大学组胚教研室全体老师的大力帮助，特表谢意)

　　本课题由江苏省科委自然基金资助　Bk95081311

　　参考文献

　　1.宋丽华，白淑清，杨伟力，等.人转化生长因子β₁对肿瘤细胞恶性表现的抑制作用，中华医学杂志，1997，77：348～450.

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　　3.Alexandrow MG,Moses HL,Transforming growth factorβ₁ inhibitis mouse keratinocytes late in G1 independent of effects on gene transcription.Cancer Research,1995,1:3928～3933.

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　　5.Paterson IC,Patel V,Sandy JR，et al,Effect of transforming growth factor beta-1 on growth regulatory genes in tumour-derived human oral keratinocytes.British Journal Cancer,1995,72：922～927.

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