肝癌患者外周血树突状细胞免疫功能低下

世界华人消化杂志 1998年第3期第0卷 研究原著

作者：李明松　袁爱力　张万岱

单位：第一军医大学南方医院消化科　广东省广州市　510515

关键词：肝肿瘤/免疫学；癌，肝细胞/免疫学；树突细胞/免疫学；HLA-DR抗原/代谢

Low immune function of peripheral blood dendritic cells in hepatocarcinoma patients

LI Ming-Song, YUAN Ai-Li and ZHANG Wan-Dai

　　department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical university, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

　　Subject headings　liver neoplasms/immunology; carcinoma, hepatocellular/immunology; dendritic cells/immunology; HLA-DR antigens/metabolism

　　abstract

　　AIM　To study the expression level of HLA-DR and B7 on the surface of peripheral blood dendritic cell (DC) in hepatocarcinoma (HCC) patients and its relationship with the immune function of DC.

　　METHODS　Peripheral blood DC of HCC patients (n=10) and healthy controls (n=10) were isolated and purified. The expression levels of HLA-DR and B7 costimulatory molecular on DC were detected and the ability of DC to induce T lymphocyte proliferation were evaluated.

　　RESULTS　The expression level of HLA-DR and B7 (VOF, 6.7±1.6, and 6.1±1.1) on DC in hCC patients was lower than that (VOF, 10.7±1.4 and 9.6±1.2, P＜0.05) in the controls. And the ability of DC to induce T lymphocyte proliferation (min^-1,3100±120 was also lower than that in controls (6200±90, p＜0.01).

　　CONCLUSION　The expression of HLA-DR and b7 on DC in HCC patients is lower and closely related to low immune function of the DC, which may be an important reason for tumors to escape from the immunology surveillance of tumor-bearing host.

　　中国图书资料分类号　R 735.7

　　摘　要

　　目的　研究肝癌患者外周血树突状细胞(DC)表面免疫分子HLA-DR及B7表达水平及其与DC免疫功能的相关性.

　　方法　以健康成人(n=10)作为对照，检测临床确诊中晚期肝癌(HCC)患者(n=10)外周血DC表面免疫分子HLA-DR及B7表达水平及DC免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力.

　　结果　HCC患者DC表面HLA-DR及B7表达水平(VOF)为6.7±1.6及6.1±1.1，明显低于对照组(10.7±1.4及9.6±1.2，P＜0.05).其DC体外诱导T细胞增殖能力(min^-1)为3100±120，亦明显低于对照组(6200±90，P＜0.01).

　　结论　.HCC患者DC表面HLA-DR及B7表达水平下降，并与DC免疫功能低下密切相关.

　　0　引言

　　树突状细胞(dendritic cell, DC)作为一种抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)，具有独特的免疫学功能，在诱导抗肿瘤免疫反应中起关键作用.而DC独特的免疫学功能取决于DC的免疫状态，尤其是DC表面HLA及B7分子等免疫分子的表达水平^［1］.一般认为肿瘤相关抗原只有在HLA的限制下才有可能激活T淋巴细胞，并进一步激活B淋巴细胞，从而启动宿主免疫系统，产生主动而特异的抗肿瘤免疫反应.而这一过程只有在B7等免疫分子的辅助下才能顺利完成. dC表面HLA及B7等免疫分子表达低下或缺失将导致DC免疫功能低下或无免疫作用.我们将检测肝癌(HCC)患者外周血DC表面HLA-DR及B7表达水平，并进一步探讨DC表面HLA-DR及B7表达水平与DC免疫功能的相关性.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　临床确诊中晚期HCC患者10例，男9例，女1例，年龄28岁～65岁，平均48.3岁，均未接受任何抗肿瘤治疗.健康成人10例(本校学员)，男女各5例，年龄20岁～24岁，平均21.2岁.抗CD3单克隆抗体(mAb)、抗HLA-DR mAb(均为Dako公司产品).抗CD83 mAb(Duke University, Thomas F. Tedder惠赠).抗B7 mAb(University of Western Ontario, Andrew Lazarovits惠赠).异硫氰酸荧光素(FITC, Sigma公司产品).尼龙毛(Sigma公司产品，成都输血研究所兰炯彩教授惠赠).流式细胞仪(FCM, Culter公司产品).³H-胸苷(³H-TdR，北京原子能研究所产品).

　　1.2 方法　①DC、T淋巴细胞分离及纯化：参照改良的Thomas方法^［2］分离及纯化DC及T细胞.主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；以E玫瑰花沉淀法除去T淋巴细胞，1 mol/ L氯化氨溶解RBC作为T淋巴细胞来源；聚丙烯Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；以L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯选择性地除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为DC. fITC标记的抗CD83 mAb特异性地显示DC，台盼蓝染色检测DC成活率.②DC表面HLA-DR及B7表达水平检测：以FITC标记的抗HLA-DR及B7 mAb按间接免疫荧光法通过FCM检测肝癌患者及正常人DC表面HLA-DR及B7表达水平(荧光值，VOF).③DC免疫诱导功能检测：检测DC诱导自体T淋巴细胞增殖反应，主要步骤如下：于16孔板中每孔加入5×10³ dC(分别来自正常人及HCC患者)、1×10⁵T淋巴细胞(与DC同源)、抗CD3 mAb 20 ng，置37℃，50 mL/ L CO₂环境中共培养5 d；加³H-TdR(3.7×10⁴/孔)继续培养12 h；常规收集每孔细胞，γ-闪烁计数器检测每分钟脉冲数(cpm)^［3］.

　　统计学处理　所有变量均表达为±s，以配对t检验分析两变量间差异性.

表1　HCC患者DC表面HLA-DR及B7表达水平及其免疫诱导力

　　2　结果　　经多步骤从HCC及正常人外周血中分离出的DC经抗CD83 mAb以间接免疫法特异性染色显示DC的纯度达80%以上，台盼蓝染色显示其活力在95%以上.新鲜分离的HCC患者DC表面HLA-DR及B7表达水平(VOF，6.7±1.6及6.1±1.1)均明显低于正常人(VOF，10.7±1.4及9.6±1.2)，两者相差显著(P＜0.05，表1).正常人及HCC患者DC诱导T淋巴细胞增殖能力(min^-1)分别为6200±90及3100±120，两者相差非常显著(P＜0.01).

　　3　讨论

　　宿主对肿瘤的排斥依赖于高效而特异的抗肿瘤免疫反应，尤其是T细胞免疫.然而要启动高效而特异的抗肿瘤免疫反应，必须具备两个先决条件：TAA；HLA及第二信号，即共刺激信号及一系列细胞粘附分子，包括B7，ICAM-1，CD40，CD14，FcyRII等.第二信号的存在是免疫细胞识别、捕捉抗原性物质，识别肿瘤细胞及免疫细胞间信息传递的必须条件之一.目前的研究^［4］表明肿瘤细胞表达有丰富的TAA；虽然肿瘤细胞普遍表达MHC-Ⅰ，但绝大部分肿瘤细胞MHC-Ⅱ表达不足或缺失；除B淋巴细胞瘤肿瘤细胞外，尚未发现其他肿瘤细胞表达B7等第二信号分子.因此肿瘤细胞本身并不能启动特异性的抗肿瘤免疫反应.正常情况下，机体的免疫系统具有完善的免疫监视作用，其APCs，主要是DC，分布于机体防御系统的第一线，具有率先识别、捕捉、处理及递呈内源性及外源性抗原的功能，从而能够及时诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应. dC不仅是职业APC，同时是一高效的天然免疫佐剂，具有免疫调节功能，因而能够诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫反应^［5，6］.而事实上荷瘤宿主抗肿瘤无免疫作用，推测可能与DC免疫功能异常有关，但迄今未见有关肿瘤患者DC免疫功能的报道.

　　本实验首次发现HCC患者外周血DC表面HLA-DR及B7表达明显低于正常人；其DC诱导免疫能力亦相应低下.提示HCC患者的DC表面HLA-DR及B7表达水平与DC免疫能力密切相关，DC表面HLA-DR及B7表达水平低下可能是导致DC免疫功能低下的重要原因.肿瘤患者DC表面HLA-DR及B7表达明显低下致DC免疫功能低下.因此，如能恢复并增强肝癌患者DC表面HLA-DR，B7及其他免疫分子的表达，将有助于恢复并增强肝癌(或许包括其他肿瘤)患者DC免疫学功能，并有可能恢复并增强宿主对肿瘤的免疫力.

　　李明松，男，1966-12-16生，湖北省黄陂县人，1988年第三军医大学本科毕业，1993年获第三军医大学医学硕士学位，1996年获第一军医大学医学博士学位，讲师，主治医师，主要从事消化道肿瘤免疫治疗的基础及临床研究，发表相关论文6篇.

　　通讯作者　李明松，510515，广东省广州市，第一军医大学南方医院消化科.

　　Correspondence to: LI Ming-Song, Department of Gastroenterology, nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong province, China

　　tel. +86·20·87705577-3101收稿日期　1997-11-26

　　4　参考文献

　　1　Chaux p. Dendritic cells and immune function in cancer. Pathol Biol,1995;43(10):897-903

　　2 Thomas R, Davis LS, Lipsky PE. Isolation and characterization of human peripheral blood dendritic cells. J Immunol, 1993;150(3):821-834

　　3 Chen L, Peter SL, Hekkstrom KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. immunol Today, 1993;14(10):483-486

　　4 Young JW, Inaba K. Dendritic cells as adjuvants for class Ⅰ major histo-compatibility complex-restricted antitumor immunity. J Exp Med,1996;183(1):7-11

　　5 Hmbilin TJ. From dendritic cells to vaccines. Lacent, 1996;16(347):705-706

　　6 Czux Cl Liu YJ, Banchereau J. Recent advances in the study of dendritic cells and follicular Dendritic cells. Immunol Today, 1995;16(1):2-4