肝细胞性肝癌AFP-mRNA检测外周血癌细胞的价值

世界华人消化杂志 1998年第8期第0卷 Original Articles

作者：张开泰¹　韩本立¹　王玉芝²

单位：1第三军医大学西南医院肝胆外科　重庆市　400038;2北京放射医学研究所　北京市　100850

关键词：肝肿瘤/诊断；癌，肝细胞/诊断；甲胎蛋白类；生物标记，肿瘤

Peripheral circulating cancer cells with AFP-mRNA detection in hepatocellular carcinoma

ZHANG Kai-Tai¹, HAN Ben-Li¹ and WANG Yu-Zhi²

　　¹Department of Hepatobilliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　²Institute of Radiation Medicine, Beijing 100038, China

　　Subject headings　liver neoplasms/diagnosis; carcinoma, hepatocellular/pathology; alpha-fetoproteins; tumor markers, biological

　　Abstract

　　AIM　To develop a diagnostic method for metastasis in HCC through detecting the peripheral circulating hepatocellular carcinoma (HCC) cells .

　　METHODS　As a specific marker of HCC cells, AFP mRNA in circulating hepatocellular carcinoma cells was detected in 30 HCC patients and several other kinds of cell lines were examined by nested reverse transcript PCR (nested RT-PCR).

　　RESULTS　AFP mRNA positivity in peripheral circulating HCC cells was 57% (17/ 30) and strongly related to portal vein tumor thrombus, intrahepatic metastasis and cell differentiation. With regard to controls, none of the samples showed AFP mRNA in peripheral circulating cells in colic and nasopharyngeal carcinoma with hepatic metastasis and cholecystolithiasis.

　　CONCLUSION　With high specificity and sensitivity, nested RT-PCR for detecting peripheral circulating cells in HCC would be of great value in diagnosing metastasis of HCC.

　　中国图书资料分类号　R 735.704.3

　　摘　要

　　目的　通过对原发性肝细胞癌(HCC)外周血中癌细胞的检测，为临床建立诊断肝癌转移的常规方法..

　　方法　以甲胎蛋白(AFP) mRNA为HCC的标记物，应用nested RT-PCR对30例HCC外周静脉全血标本及不同细胞株进行检测及分析.

　　结果　HCC患者30例外周血癌细胞阳性检出率为56.7%，并与肝内静脉癌栓形成(11/ 13，84.6% vs 6/ 17， 35.3%)、肝内转移(16/ 23，69.6% vs 1/ 7，14.3%)和细胞分化密切相关(P＜0.05)；最低检出浓度为全血肝癌细胞2×10⁴/ L. 对照组中结肠癌、鼻咽癌等肝转移癌以及胆囊结石患者的外周血中均未发现AFP mRNA.

　　结论　Nested RT-PCR对HCC的检测具有较强的特异性和较高的灵敏度，对于HCC诊断、判断转移可能具有较为重要的临床应用价值.

　　0　引言

　　目前临床上尚未建立一种能动态检测原发性肝细胞癌(HCC)尤其是手术后发生转移的常规方法. 从HCC患者外周静脉血中收集癌细胞并对其特异性标记物进行扩增将可能成为诊断HCC转移的重要手段之一. 我们拟采用AFPmRNA作为外周血HCC细胞的标记物，为建立监测HCC复发、转移作初步的探讨.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　西南医院1996-03/ 1996-11住院手术HCC 30例，对照组18例，其中肝转移癌8例，胆囊结石10例. 手术前3 d抽取外周全血，肝素抗凝，分离有核细胞，液氮冻存. HCC组：HCC细胞HpG2,PLC/ PRF；对照组：急性白血病细胞HL60，肺小细胞癌细胞KHC. 37℃，50 mL/ L CO₂，PRIM1640待细胞生长旺盛时收集细胞制成1×10⁹/ L悬液. 为进行灵敏度检测，HpG2分别按细胞数10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹及10⁰悬浮于5 mL正常全血中.

　　1.2 方法　①AFP引物合成：外侧引物为5＇-ACTGGAATCCAGAACACTGCATCG-3＇,5＇-TGCAGTCAATGCATCTTTCACCA-3＇；内侧引物为5＇-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3＇；5＇-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGG-3＇. 内参照β-actin引物：5＇-CGAGAAG ATGACCCAGATCA-3＇，5＇-GATCTTTCATGAGGTAGTCAT-3＇. ②套式逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)收集细胞，裂解后酚：氯仿抽提mRNA，异丙醇沉淀过夜，真空干燥，加入反转录体系，合成第一条cDNA，采用不同引物分别进行两次PCR扩增，每次30循环.

　　统计学处理　所有数据采用美国SAS统计软件进行Fisher精确概率分析.

　　2　结果

　　2.1　不同细胞株AFPmRNA表达　在1×10⁶的相同数量下，对照组肺癌细胞、白血病细胞未检出AFPmRNA，凝胶电泳无非特异带出现，仅见内参照光带；HpG2与PLC/ PRF肝癌细胞具有AFPmRNA表达，电泳图谱中呈现AFPcDNA特异光带(图1).

　　2.2 HpG2细胞不同稀释度AFPmRNA表达丰度　0.2×10⁹/ L～0.2×10⁵/ L细胞稀释度范围内HpG2细胞均有强弱不等的特异性光带出现，最低阳性浓度为0.2×10⁵/ L. 0.2×10⁴/ L浓度以下便不再有特异带出现(图2).

　　2.3 临床病例AFPmRNA的检出率　HCC AFPmRNA的阳性率为56.7%(17/ 30)，对照组结肠癌、鼻咽癌以及胆囊结石等外周血中AFPmRNA检出率为0%(0/ 18). 在HCC病例中，伴有肝内静脉癌栓形成者AFPmRNA阳性率为84.6%(11/ 13)，伴肝内转移者阳性率为69.6%(16/ 23)，AFPmRNA阳性率与肝内转移、肝内静脉癌栓形成呈正相关(P＜0.05，表1).

表1　外周血HCC细胞AFP mRNA与不同病理因素的相关分析

　　^aP＜0.05，vs AFP mRNA阳性组.Endmondson分级.

图1　不同细胞株AFP cDNA电泳图

　　A，B：HpG2 (肝癌细胞)　C，D，E：HL60 (白血病细胞)

　　F，G，H，I： KHL (肺癌细胞)　J，K： PLC/ PRF (肝癌细胞)

　　图2　HpG2细胞在不同浓度下AFP cDNA电泳图

　　A：1×10⁶；　B：1×10⁵；　C：1×10⁴；　D：1×10³；

　　E：1×10²；　F：1×10¹；　G：1×10⁰

　　3　讨论　　AFP存在于胚胎早期，大部分由胚胎期肝细胞和卵黄囊产生，到胚胎wk 7出现在母体血清中，wk 14达到最高水平，出生后浓度迅速下降直至消失. 肝脏的其他细胞如Kupffer细胞、胆管上皮、储脂细胞、血管内皮细胞并不合成AFP. 如果AFP浓度增高重现于成人血清，往往提示与胚胎发生有关的HCC或生殖腺胚胎癌. 因此，HCC的诊断必须排除活动性肝病、妊娠、生殖腺胚胎癌等. 虽然如此，AFP在HCC的诊断中，仍然不失为非常有价值的生化指标，尤其是HCC的早期动态观察与诊断^［1］.

　　肝脏位于体循环与门静脉系统的交汇处，血液供应相当丰富，HCC细胞在早期即可侵袭血管进入外周循环，HCC的这一特点使在外周血中检测HCC细胞成为可能. AFPmRNA在细胞质内是翻译、合成AFP的物质基础，游离在外周血中的mRNA非常不稳定，易被RNA酶降解. 因此，AFP mRNA只能存在于尚具活性的HCC细胞中^［2］. 在排除包括生殖器肿瘤在内的其他有关因素干扰的前提下，只要在外周血中检测到AFP mRNA就能肯定HCC细胞在原发部位已经突破血管壁并侵袭到外周血中. 本结果证实，外周血癌细胞中AFP mRNA的出现与肝癌转移、门静脉癌栓形成密切相关. 肝内转移与门静脉癌栓形成均表明HCC已经侵袭到了血循环. 因此可以认为，外周血AFP mRNA是HCC细胞存在于外周血的直接证据，是HCC发生血管浸润并形成或可能形成转移的重要标志.

　　PCR扩增效率高，其产物以2ⁿ-2n的形式堆积. 理论上认为25～30个循环后产物可达到最大值，目的基因的拷贝可超过4×10⁸. 套式PCR的特点在于对同一模板使用两对引物分别进行两次扩增，对于RNA模板拷贝数少的目的基因具有明显的扩增效果；而且目的基因的特异性也得到增强. 据文献报道，采用Nested RT-PCR检测乳腺癌、黑素瘤、结肠癌等外周血癌细胞mRNA的灵敏度最高可达全血200个/ L^［3，4］. 本实验的结果也表明，应用Nested RT-PCR对HCC AFP mRNA的检测也具有较高灵敏度和较强的特异性. 运用Nested RT-PCR方法检测外周血AFP mRNA有其自身特点，它与血清AFP浓度无关，可在血清AFP＜500/ mL的HCC病例中检测出AFP mRNA以证实外周血中存在的肝癌细胞. 因此，AFP mRNA可以在肝癌影像检查不典型、血清AFP浓度低下的情况下作为肝癌诊断以及判断转移的又一辅助指标.

　　张开泰，男，1963-10-01生，重庆市人，1987年华西医科大学毕业，1993年第三军医大学外科硕士，1997年第三军医大学外科博士，现军事医学科学院博士后，主要从事肝胆外科临床工作.

　　通讯作者　张开泰，100038，北京放射医学研究所，北京海淀区太平路27号.

　　Correspondence to:ZHANG Kai-Tai, Institute of Radiation Medicine, 27 TaiPing Road, Beijing 100038, China

　　Tel. +86·10·66828340

　　收稿日期　1998-05-06

　　4　参考文献

　　1　吴孟超. 1000例肝细胞癌的临床病理研究. 肿瘤防治，1993；20(1)：137-139

　　2　Niwa Y, Matsumura M, Shiratori Y. Quantitation of alpha-fetoprotein and albumin messenger RNA in human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1996;23(6):1384-1392

　　3　Datta YH, Adama PT, Drobyuski WR. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse transcriptase polymetase chain reaction. J Clin Oncol, 1994;12(3):475-482

　　4 Ferhard M, Juhl H, Kalthoff H. Specific detection of carcinoembryonic antigen-expression tumor cells in bone marrow aspirates by polymerase chain reaction. J Clin Oncol, 1994;12(4):725-729