端粒酶与原发性肝癌

世界华人消化杂志 2000年第4期第8卷 文献综述

作者：傅建民　余小舫　邵永孚

单位：傅建民　余小舫（深圳市人民医院暨南大学医学院第二附属医院普外科 广东省深圳市 518020）；邵永孚（中国医学科学院肿瘤医院腹部外科 北京市 100021）

关键词：端粒；端粒酶；肝肿瘤

　　 我国是肝癌高发国家，其年发病率位于全部恶性肿瘤的第四位，而病死率位于第二位，严重威胁我国人民健康[1]．有关肝癌发生，发展，转归的研究尚存许多疑点．近年来国外学者广泛开展了有关端粒酶活性的研究，发观绝大多数恶性肿瘤细胞均呈端粒酶活性阳性，而在正常人体组织中却无表达(在人生殖细胞，一些淋巴细胞和造血细胞中除外)[2]，提示端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，成为近年来分子肿瘤学研究的热点，本文就有关原发性肝癌端粒酶活性的研究新进展综述如下。1端粒的结构与功能早在20世纪30～40年代，Muller和McClintock就发现端粒对于染色体稳定和其基因组的完整是十分重要的．1978年耶鲁大学的Biackburnetal[3]在对单细胞生物四膜虫的研究中发现了端粒，证实端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊结构，由简单重复的富G的DNA序列及其相关蛋白组成，人和脊椎动物的端粒DNA序列为(5'-TTAGG-3’)n．端粒与细胞的寿命控制关系密切，人体细胞在体外培养过程中只能经历有限的有丝分裂次数，Olovnik[4]在70年代末首次提出了染色体末端的逐渐丢失会导致细胞最终退出周期，随着细胞有丝分裂的进行，端粒长度会逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度，就不能维持染色体的稳定，最终导致细胞死亡，Allsoppetal[5]发现年龄和端粒长度及细胞增殖能力无关，而端粒长度与细胞在培养过程中所能分裂的次数相关，提出端粒可能是细胞有丝分裂的“计时器”。端粒的功能主要是：①稳定染色体末端，避免染色体重组和末端降解；②防止染色体复制时缩短。2端粒酶2．1端粒酶的发现及其结构1985年Greideretal[6]利用四膜虫的无细胞提取物在体外进行端粒，“加尾”实验，发现了端粒酶，1989年Morin[7]首先在Hela细胞中发现了活化的端粒酶．端粒长度的维持需要端粒酶的激活，端粒酶是核糖蛋白(BNP)，含有与端粒DNA互补的RNA，它有别于一般的DNA聚合酶、是一种专一的逆转录酶，能以自身的PNA组分为膜板从头合成端料，以被偿细胞分裂时染色体末端的缩短，解决末端复制问题，端粒酶中RNA成分对其作用十分重要，用Rnase切割RNA-DNA复合物时，酶即使去活性[2]。2．2端粒延长的机制研究者根据端粒DNA和端粒酶的特性提出了端粒延长的模型，即分为3个步骤：①端粒酶对染色体末端的识别与结合．②染色体末端以酶内RNA为模板添加互补的核苷酸并聚合．③移位使端粒得以连续拷贝，另外，端粒酶还可在染色体断裂处直接加上d(TTAGGG)n顺序而使断裂愈合，端粒酶介导愈合的染色体断端绝大多数具有互补于端粒酶内部RNA模板的顺序[8]1端粒酶活化与细胞永生化近年研究发现，端粒酶能赋予体内和体外细胞旺盛的增殖能力，而使之永生化．随之下来提出了端粒假说[9]，即在细胞有丝分裂过程中，端粒长度逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度可触发某种信号，使细胞进入M1期，不再分裂而出现老化，如果细胞被病毒转化(SV40T抗原)，或者某些抑癌基因(P53，RB，P16)的突变，细胞可以越过M1期继续分裂，染色体出现各种异常变些(端粒融合、环状染色体、双着丝粒染色体)，绝大多数细胞在M2期死亡，但同时极少数细胞在此阶段激活了端粒酶，端粒长度得以稳定，使细胞越过M2期而获得永生化[10，11]。研究发现，在体外培养的永生化细胞和肿瘤细胞均存在端粒酶活化，而且在人体绝大部分肿瘤组织中均检测到端粒酶活性，由此看来，端粒酶与永生化细胞和肿瘤细胞之间存在特殊关系，可能由于肿瘤细胞中端粒酶激活，以维持端粒长度的稳定，使肿瘤细胞得以无限增殖[12]。4端粒酶活性检测方法1993年，Nilssonetal[13]通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离应产物，行放射自显影后可见到间隔6bp的梯形图象，印由于每合成6个核苷酸后端粒酶活性出现停顿，据此“六碱基梯子”可检测端粒酶活性，但是此检测方法需要组织标本量较大，且酶活性易受其他因素干扰，应用受到局限，1994年，Kimetal[2]对端粒酶活性检测方法加以改进，即TRAP法(telomemricrepeatamplificationprotocal)，在此方法中，端粒酶逆转录出一段DNA，并通过PCR进一步扩增，使端粒酶活性桂出敏感性提高104倍，在近100个人类细胞中检测到端粒酶活性，此方法简便易行，具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，现己广泛采用，Hiyamaetal[5]在此基础上，对z同稀释度的组织提取物进行端粒酶活性半定量检测，发现此检测方法敏感性极高，能检测到微量端粒酶活性，Ohyashikietal[l6]改用荧光标记引物的方法，端粒酶活性表达可通过仪器扫描后的荧光曲线，利用其峰高和峰面积来计算，此方法可用于半定量分析，并在90min内得到结果，但是比方法对定量测定低水平的端粒酶活性表达有局限性，1996年，XuElietal[17]建立了端粒酶活性定量检测方法，即将TRAP产物移置96孔板，加入梯度稀释的PicoCreen(1：200)，应用流式细胞荧光染色技术，其荧光强度与DNA浓度呈线性关系，藉此定量检测端粒酶活性。5肝癌组织中端粒酶活性检测研究Kimetal于1994年创建了TRAP检测端粒酶活性的新方法，并研究了18种不同组织的100株永生化细胞，其中有98株端粒酶活性阳性；在101个恶性肿瘤活检标本中，有90个标本星端粒酶活性阳性，而在正常细胞株和正常组织标本中，端粒酶活性均呈阴性表达，Kim认为端蛹粒的长度不能作为衡量端粒酶活性的可靠标记，某些肿瘤组织的端粒明显短于正常组织，而端粒酶活性表达的强弱可作为恶性肿瘤发展的衡量指称，近年来研究成果表明，在人类绝大多数肿瘤组织中端粒酶活性的高表达，如卵巢癌(100％)[18]、乳腺癌(93％)[15]、大肠癌(95．6％)[19]、胃癌(85％)20、前列腺癌(84％)[2]、肺癌(80％)[4]、肾癌(75％)[21]、膀胱癌(97％)[22]等等。而在邻近正常人体组织细胞或良性肿瘤组织中多为阴性或弱阳性表达，所有的研究均揭示，端粒酶在人类恶性肿瘤组织细胞中普遍存在，肿瘤发生、发展过程中起着重要的作用。Tabaraetal[23]于1995年首先报道了肝胆瘤和慢性肝病组织中端粒酶活性检测研究结果，在33例原发性肝细胞癌(HCC)中有28例(22例高活性，4例中活性，2例弱活性)组织端粒酶活性表达阳性，阳性率为85％，其中直径(＜3cm的18例小肝癌中有15例表达阳性，阳性率高达83％．HCC端粒酶活性表达与肿瘤大小和组织学分级无关，在HCC癌旁组织中仅有l/22表达端粒酶弱活性，在肝硬变和急慢性炎组织中未见端粒酶高、由活性表达，但呈25/46的弱活性表达，阳性率为55%；而正常肝组织中未检测到端粒酶活性．Shayetal[24]总结了近2a来文献报道的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为149/173(86％)，癌旁阳性率为1/50(2％)，正常肝组织中未见端粒酶活性，其结果提示端粒酶活性表达在HCC的发生，发展过程中起重要作用，有鉴于此，Kazuhiroetal[25]对经皮肝穿刺组织进行端粒酶活性检测，以鉴别诊断HCC，结果20／25HCC端粒酶阳性表达，其中≤2cm和高分化的HCC端粒酶活性表达分别为100％(5／5)和87．5％(7／8)，可见检测端粒酶活性表达对鉴别诊断高分化的小肝癌有重要的临床应用价值，HCC癌旁肝组织为慢性肝炎和肝硬变，其端粒酶活性均为弱表达，阳性率为11/29(37．9％)；非癌旁的慢性肝炎和肝硬变组织，其端粒酶活性阳性率为6/35(17．1％)，亦均为弱活性；而正常肝组织中未检测到端粒酶活性，此结果提示：①端粒酶活化可能在慢性肝炎→肝硬变→HCC的发生发展过程中起重要作用。②HCC癌旁肝组织的端粒酶活性较高表达可能与肝内转移和复发有关，在以后的许多研究工作中，得到了相似结果[26-29]。6端粒酶活性与HCC诊断治疗的临床应用前景6．1应用于诊断首先，B超引导下经皮肝穿刺组织中检测端粒酶活性用于诊断HCC，可以弥补细胞破碎或细胞形态不完整等等导致的细胞学诊断失误，但是，由于慢性肝炎和肝硬变组织中存在着部分端粒酶弱活性，需借助于精确的半定量分析以鉴别诊断HCC，另外检测腹水细胞由的端粒酶活性，有助于鉴别诊断癌性腹水和判断HCC临床分期，收集术中腹腔冲洗液进行端粒酶活性检测，亦可辅助评价无瘤技术和无瘤原则，对提高HCC根治性切除水平有重要意义。6．2应用于判断预后既往的研究结果，Hiyamaetal[15]对140例手术切除的乳腺癌标本研究发现，130例端粒酶阳性(94％)．其中I期乳腺癌端粒酶阳性率为87％，而晚期乳腺癌则为95％；作者还对125例乳腺癌患聿生存进行多因素分析，发现端粒酶活性与乳腺癌的分期有显著的相关性，并认为端粒酶阴性或活性低患者的预后较好，Hiyamaetal[20]对胃癌的研究也得出类似的结论，另外，Nousoetal[30]通过对肝癌的研究发现，高分化肝癌的端粒酶阳性率为42．9％(3/7)，而且均为弱阳性；而中等分化程度的肝癌细胞端粒酶阳性率为92％(12／13)，并均为强阳性．从以上研究我们可以看出，端粒酶与肿瘤的恶性行为有一定的关系，虽然目前研究提示端粒酶活性表达与HCC侵袭性无显著相关，但是，如果能完善端粒酶活性的定量检测，可以阐明端粒酶活性的强弱与HCC临床病理特征的关系，此外，HCC癌旁组织中的端粒酶弱活性表达，有可能提示HCC肝内转移和复发，对于判断HCC的预后可能有指导作用，此问题有待于大样本的前瞻性研究。6．3应用于HCC治疗以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究国外已有报道，科学家们提出以端粒酶为靶点的肿瘤抑制策略，期望能开发出抑制端粒酶活性或基因表达的抑制剂，使肿瘤细胞不能有效合成端粒序列，从而发生“凋亡”，达到治愈肿瘤的目的，主要有以下途径：①阻断端料酶RNA的模板作用抑制端粒酶活性，Fengetal[31]报道利用反义RNA抑制体外培养Hela细胞的端粒酶活性，使其连续分裂23-26代后死亡．但这一方法的体内应用须解决Rnase降解的问题。Yuetal[32]提出制备突变的端粒酶RNA，使突变的RNA与内源野生型RNA竞争端粒酶蛋白，使染色体不能形成稳定的端粒．诱发细胞凋亡．Nortonetal[33]设计了针对hTR模板区不同长度的反义肽苷酸(PNA)，对细胞提取物和细胞为的端粒酶活性有显著抑制作用，该抑制作用有严格的序列特异性，并随PNA长度的增加和浓度的升高而增强，PNA因其高度亲合性、特异性及抗降解能力，成为极有发展前途的抗癌药物，另外，核酶对端粒酶活性也有抑制作用，Kanazawaetal[34]设计了一种锤型核酶{Telo-RZ)，与肝细胞癌细胞株HepG2共育，使端粒酶活性明显受抑制，有望成为广普、低毒、有效的抗癌新药．②核苷类似物抑制端粒酶活性．目前核苷类似物的作用机制可能为：①底物抑制作用，即核苷类似物与端粒酶活性位点相结合，形成端粒酶核苷复合物，从而抑制端粒酶活性，②核苷类似物掺入端粒DNA中，形成不稳定的DNA-端粒酶RNA复合物，导致端粒DNA从端粒酶中解离．③7-脱氪-dNTP阻碍鸟嘌岭四聚体等二级结构的形成，导致端粒合成受阻[35]。3.细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性，人类正常肝细胞经过分化，端粒酶活性受到抑制，Bestilnyetal[36]利用细胞分化剂视黄酸(RA)诱导HL-60细胞分化为成熟的单核细胞和粒细胞，发现端粒酶活性和细胞增殖能力明显被抑制，其机制有待于进一步研究，无论如何，端粒酶抑制剂对人体组织所产生的毒性作用必须重视。

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收稿日期：1999-10-19