端粒酶活性与儿童急性淋巴细胞白血病相关性的研究

中华儿科杂志 1998年第10期第0卷 论　　著

作者：高举　廖清奎　罗春华　李钦伯　杨崇礼　李丰益　杨显军

单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院儿科

关键词：端粒；末端转移酶；白血病；淋巴细胞；急性

　　【摘要】　目的　了解端粒酶在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达情况。方法　采用端粒重复序列扩增法（TRAP）检测了14例儿童急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞端粒酶活性水平，并与10例正常健康儿童外周血和骨髓单个核细胞端粒酶活性相比较。结果　白血病细胞端粒酶活性显著升高，可高达K562白血病细胞端粒酶活性的75%～98%，而正常外周血和骨髓单个核细胞具有适度低水平的酶活性，其相对活性为K562细胞的1.3%～5.7%。结论　端粒酶的激活在急性淋巴细胞白血病的发生发展中可能具有重要作用。

　　The association between telomerase activity and acute lymphoblastic leukemia in childhood　Gao Ju, Liao Qingkui, Luo Chunhua, et al. Department of Pediatrics, Second Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu 610041

　　【Abstract】　Objective　To determine whether telomerase is activated in childhood acute lymphoblastic leukemia.Methods　A highly sensitive PCR-based assay-telomeric repeat amplification protocol (TRAP) was employed to measure telomerase activity in extracts of peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 14 leukemic patients and 10 normal children, respectively.Results　Significantly high level of telomerase activity was expressed in leukemic blast cells, with the telomerase activity in the range of 75%-98% of reference K562 leukemic cells. While normal peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from normal childern had a very low, but detectable, level of telomerase activity, which was 1.3%-5.7% of the K562 cells.Conclusion　Telomerase activation may play an important role in leukemogenesis.

　　【Keywords】　Telomerase　　Leukemia, lymphocytic, acute

　　端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体,它能以自身RNA的部分序列作为模板,指导端粒DNA的生物合成^［1］。近年的研究表明，各种体外培养的永生细胞株和90%以上各种人类原发恶性肿瘤细胞具有端粒酶活性，提示端粒酶的激活可能是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径，而端粒酶本身也可能是各种恶性肿瘤细胞共同的标记分子^［2～4］。

　　为了解端粒酶在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达情况，采用端粒重复序列扩增法（TRAP）检测儿童急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞端粒酶活性水平，并与正常外周血和骨髓单个核细胞端粒酶活性相比较，初步探讨端粒酶活性与儿童急性淋巴细胞白血病的相关性。

材料和方法

　　一、材料

　　1.K562白血病细胞株（本校免疫教研室惠赠）。

　　2.临床标本的收集：(1)根据小儿急性白血病诊疗建议(修订草案)^［5］，共收集14份儿童初发急性淋巴细胞白血病（ALL)骨髓肝素抗凝标本。年龄2～14岁，其中男9例，女5例。L₁ 8例，L₂ 5例，L₃ 1例。（2）健康儿童外周血肝素抗凝标本共10份，年龄2～10岁。男6例，女4例。（3）因非肿瘤性疾病而行骨髓检查的患儿骨髓肝素抗凝标本共10份，年龄1～12岁，其中男5例，女5例。

　　二、方法

　　1.K562细胞的培养、裂解和端粒酶提取液的制备：K562细胞培养于RPMI-1640培养液(加10%小牛血清)，于37℃、5%CO₂ 的培养箱中培养。收集K562细胞后离心5分钟［1 000 g(g为重力常数)］， 沉淀后用PBS洗涤2次。计数细胞总数为3.5×10⁶个，台盼蓝染色示活细胞大于95%。将K562细胞重悬于预冷的清洗缓冲液中(10 mmol/L HEPES，pH7.5；1.5 mmol/L MgCl₂；10 mmol/L KCl；1 mmol/L 二硫苏糖醇)，离心2分钟后(4℃，10 000 g)，将细胞重悬于200 μl预冷的裂解缓冲液中(10 mmol/L Tris HCl，pH 7.5；1 mmol/L MgCl₂；1 mmol/L EGTA；0.1 mmol/L AEBSF；5 mmol/L巯基乙醇；0.5%CHAPS，10%甘油)。置冰上孵育30分钟，然后于4℃离心30分钟(16 000 g)。迅速取出上清液，于液氮中快速冻存。后转移至-70℃冰箱保存备用。采用Folin-酚试剂法测定蛋白水平，总蛋白浓度为3.5 μg/μl。

　　2.外周血和骨髓单个核细胞(MNC)的分离和裂解：初发ALL患儿骨髓幼稚细胞计数均大于85%。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血和骨髓单个核细胞后，用PBS洗涤2次并计数。裂解和端粒酶提取液的制备同上。

　　3.聚合酶链反应(PCR)：(1)标准反应条件为：PCR总反应体积50 μl，包括20 mmol/L Tris HCl，pH　8.3；1.5 mmol/L MgCl₂；63 mmol/L KCl；1 mmol/L EGTA；0.005% Tween-20；0.01%牛血清白蛋白；1 μg T4基因32蛋白；2单位Taq酶，50 μmol dNTPs；0.1 μg TS 引物（5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′）；0.1 μg CX 引物（5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′）和2 μl K562细胞提取液。于23℃孵育30分钟，然后于90℃首先作用90秒，然后进行35次PCR循环：94℃30秒，50℃30 秒，72℃45秒，最后于72℃保温3分钟后终止反应。(2)TRAP的特异性：在标准反应条件下以及分别省去引物、底物、Taq酶和细胞提取液，并对细胞提取液完成各种预处理措施后，进行TRAP反应。细胞提取液的预处理措施包括：①RNase A预处理：10 μl 提取液中加入RNase A 1 μg，于37℃孵育1 小时后取2 μl于标准反应体系中。②预加热处理：将10 μl提取液加热10分钟（85℃），然后取2 μl于标准反应体系中。③蛋白酶K（proteinase K）预处理：10 μl提取液中加入Proteinase K 3 μg，于37℃孵育30分钟，然后取2 μl于标准反应体系中。(3) TRAP方法的敏感性：将K562细胞提取液10、100、1 000倍稀释后，分别取2 μl于标准反应体系中。(4)MNC的扩增采用标准反应条件，但加入相同蛋白含量的提取液，便于端粒酶活性的相互比较。

　　4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：TRAP扩增产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压10～15 V/cm。DNA分子量标准为pBR322/HaeⅢ。

　　5.凝胶的SYBR GreenⅠ染色：将SYBR GreenⅠ浓缩液稀释10 000倍成使用液，染色30分钟，于紫外投射仪上观察DNA条带。

　　6.凝胶的GDS成像和分析：于UVP GDS-8000凝胶成像分析系统，采用GRAB-IT和GEL WORKS intermediate 软件对凝胶进行成像分析。先求出每一条带的峰面积（Volume），得出每一泳道（Lane）的峰面积的总和，并扣除阴性对照的背景值，即为每一标本的端粒酶活性。

结果

　　一、TRAP方法的特异性和敏感性

　　在分别省去引物、底物、Taq酶和端粒酶液，并对端粒酶液完成各种预处理措施后行TRAP反应，均未出现端粒酶特异性的DNA梯带。因此，标准条件下经TRAP反应扩增出的相差6个核苷酸的DNA梯带，真实反映了端粒酶的活性。另外，将K562细胞提取液1 000倍稀释后（相当于35个K562细胞，7 ng蛋白）仍可检出阳性结果。

　　二、正常外周血单个核细胞(MNC)端粒酶活性的检测

　　10例正常外周血MNC标本均检出端粒酶活性，其相对端粒酶活性为K562细胞的2.0%～3.5%。

　　三、非肿瘤患儿骨髓MNC端粒酶活性的检测

　　10例非肿瘤患者骨髓MNC标本均检出端粒酶活性，其相对端粒酶活性为1.3%～5.7%。

　　四、ALL骨髓MNC端粒酶活性的检测

　　在14例儿童初发ALL骨髓MNC中除2例外，均检出较高水平的端粒酶活性，其相对活性为75%～98%。

讨论

　　本研究结果表明，正常外周血和骨髓MNCs具有低水平的端粒酶活性，可达K562细胞的3.5%。国外文献资料显示，80%以上正常外周血和骨髓MNC的相对端粒酶活性为2%～10%^［6～8］。尽管选用的参照细胞系各不相同，但结果基本一致。本组10例正常外周血MNC标本端粒酶活性较低，可能由于SYBR GreenⅠ的检测敏感性低于同位素标记和放射自显影方法所致。

　　正常外周血和骨髓中具有适度端粒酶活性表达的细胞可能是某些特定的造血干细胞^{［6，7，9］}。低水平的端粒酶活性既能减缓这类细胞端粒缩短的速度，使其增生分裂能力有一定程度的增强，保证了血液细胞充足的自我更新能力，又不足以使其无限度地分裂增生成为永生细胞，从而导致恶性肿瘤的发生^［7，8］。另外，除造血细胞外，正常表皮基底细胞、肠粘膜上皮细胞等具有高度分裂增生和自我更新能力的细胞也有一定水平的端粒酶活性，表明端粒酶的适度表达在细胞的增生调控机制方面也可能具有重要作用^［8］。

　　另一方面，正常外周血或骨髓中的端粒酶表达细胞也可能是受抗原刺激而激活的免疫细胞。端粒酶在这些细胞中低水平的表达，对于免疫细胞的克隆扩增和正常的免疫功能有着重要的作用^［9～11］。

　　本结果还表明，ALL骨髓MNC具有较高水平的端粒酶活性，明显高于正常外周血和骨髓MNC端粒酶水平。这一结果与Broccoli等^［7］报道的ALL病例组端粒酶水平相当，但有两例ALL未检出端粒酶活性，可能与端粒酶在制备过程中被降解有关。文献报道，对慢性白血病的研究表明，在慢性白血病的慢性期，白血病细胞端粒酶水平与正常MNC端粒酶水平相当^{［6，7，12］}。一旦发生急性变，端粒酶活性则有显著升高，提示这可能与白血病细胞在两种疾病状态下的增生能力和分化程度不同有关。因为研究发现端粒酶活性水平与细胞周期有关，静息期细胞(G₀期细胞)端粒酶表达受阻抑，而增生期细胞(G₁、S、G₂和M期细胞)有端粒酶活性^［13］。同时，细胞端粒酶活性水平尚与细胞的分化程度成负相关^［14］。

　　综上所述，ALL白血病细胞具有较高水平端粒酶活性，可能对ALL的诊断具有重要价值。但由于本组病例数较少，而且不同病例间端粒酶活性差异较大，因此需要进一步研究来阐明端粒酶检测在ALL诊断和演进方面的作用。

　　本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39670767)

　　参考文献

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(收稿：1997-12-04　　修回：1998-05-09)