腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响

中国普外基础与临床杂志 2000年第6期第7卷 基础与实验研究

作者：王征旭　何振平　吴祖泽

单位：王征旭 何振平（第三军医大学西南医院全军肝胆外科中心重庆　400038）；吴祖泽（军事医学科学院百环生物医学研究中心　北京　100850）

　　关键词： 肝细胞癌；腺病毒；多基因；基因治疗；凋亡

　　【摘要】　目的　研究腺病毒介导的多种基因在肝癌细胞中的表达和对肝癌细胞生长的影响。方法　构建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-2 4种目的基因的重组腺病毒载体，感染3种肝细胞癌细胞系和肝细胞系L02，运用ELISA、免疫组化、流式细胞仪等方法，检测目的基因在肝癌细胞中的表达，和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果　肝癌细胞对腺病毒高度易感，腺病毒多重感剂量为50(50 MOI)时，可使90%左右的肝细胞癌表达目的基因。除IL-2外，其他3个目的基因都能在肝癌细胞中高效表达。导入多基因后，肝癌细胞的生长受到一定程度的抑制，并诱导肝癌细胞发生凋亡； 而L02肝细胞的生长却未受影响。结论　腺病毒载体是进行肝癌基因治疗的理想载体，由一个腺病毒载体介导的多种目的基因，能在肝癌细胞系中高效表达，且能抑制肝癌细胞的生长和诱导其调亡。

　　【中图分类号】　R730.54； R735.7； Q782　　　【文献标识码】　A

　　【文章编号】　1007-9424(2000)06-0357-03

EFFECTS OF ADENOVIRAL VECTOR-MEDIATED MULTIGENES ON LIVER CANCER CELLS GROWTH

WANG Zheng-xü

　　(Center of Hepatobiliary Surgery, The South West Hospital, The Third Military Medical Sciences, Chongqing 400038)

　　HE Zhen-ping, WU Zu-ze.

　　【Abstract】　Objective　To investigate the expression of multigenes mediated by adenovirus in liver cancer cells and the effects on growth of cells transducted with multigenes. Methods　By construction of recombinant adenovirus containing human p53, B7-1, GM-CSF, and IL-2 genes (Ad-multigenes), the expression level of target genes in three human hepatocellular carcinoma cell lines and a human hepatocellular cell line L02 was detected using ELISA, immunohistochemistry and FACS assay and the change of growth of these cells and the tumor cell apoptosis were observed. Results　The human hepatic cells and liver cancer cells were all sensitive to adenovirus infection. At a MOI of 50 PFU/cell, among the cells examined nearly 90% were positive expression and except IL-2, other three genes were expressed with high efficiency. The growth of Ad-multigenes-transduced liver cancer cell lines was inhibited and apoptosis was induced, but the growth of Ad-multigenes-transduced normal hepatic cell line L02 did not change. Conclusion　These results indicate that the adenovirus is an efficient vector for gene transfer into human liver cancer cells. These liver cancer cell lines transduced with multigenes constructed on one recombinant adenoviral vector can highly express target genes and their growth was inhibited, and apoptosis appeared.

　　【Key words】　　Hepatocellular carcinoma　　Adenovirus　　Multigenes　　Gene therapy　　Apoptosis

　　肝癌在我国目前已处于恶性肿瘤死亡率的第2位^〔1〕，因大部分肝癌患者不能手术根治，且肝癌相对于其它恶性肿瘤而言，对放、化疗都不敏感，临床上迫切需要新的治疗尝试，以解决这一难题。目前人们对肿瘤的发病机理和免疫逃避机理的认识还十分局限，尚无公认的肿瘤基因治疗模式^〔2〕。从肿瘤治疗的实验出发，在肿瘤基因治疗中既要考虑导入的目的基因对肿瘤细胞生长的抑制或诱导其凋亡的作用，又要考虑到有利于提高肿瘤细胞的免疫原性，从而调动和增强机体对肿瘤的免疫能力。本研究构建了同时含人野生型p53抑癌基因、共刺激分子(B7-1)、粒巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-2)基因的重组腺病毒载体，并研究其在肝癌细胞系中的表达，为临床上开展肝癌的基因治疗提供必要的理论基础资料。

　　1　材料与方法

　　1.1　构建单、双顺反子重组腺病毒载体

　　E1、E3区缺失的腺病毒—多基因(Ad-multigenes)载体，同时含人p53、B7-1、GM-CSF及IL-2基因，其中两个目的基因p53和GM-CSF及B7-1和IL-2之间，靠脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)相连^〔3〕； 腺病毒-p53(Ad-p53)载体仅含人野生型p53抑癌基因； 腺病毒—绿色荧光蛋白(Ad-GFP)载体含绿色荧光蛋白标记基因。

　　1.2　细胞培养

　　人肝癌细胞系HepG2、人胚肾细胞系293细胞(含5型腺病毒E1片段)、Wistar大鼠近交系癌肉瘤Walker 256细胞均购自美国ATCC公司。人肝癌细胞系BEL-7402及SMMC7721由军事医学科学院二所三室提供。正常人肝细胞系L02购自中科院上海细胞生物学研究所。Walker 256细胞系Wistar大鼠腹水传代培养，体外培养于含15%胎牛血清的RPMI 1640(GIBCO)中，其余细胞均培养于含10%胎牛血清的高糖型DMEM(GIBCO)中。

　　1.3　检测肝癌细胞系对腺病毒的感染效率

　　肝癌细胞以10⁴个/孔接种于24孔板，12小时后感染具不同腺病毒多重感染剂量(MOI)的Ad-GFP，48小时后在荧光倒置显微镜下计数发绿色荧光的细胞数占该视野全部细胞的百分率，每皿重复计数3次。

　　1.4　检测目的基因在肝癌细胞系中的表达

　　60 mm平皿接种5×10⁵个细胞，12小时后感染50 MOI的Ad-multigenes，每24小时换1 ml新鲜培养液，用ELISA法检测IL-2及GM-CSF的表达量(Genzyme公司)。10⁶个细胞接种60 mm平皿，感染50 MOI的Ad-multigenes后48小时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的B7-1(CD80)鼠抗人单克隆抗体(Pharmingen公司)与靶细胞在室温共同孵育30分钟，磷酸生理缓冲液(PBS)液洗3遍，用流式细胞仪(B&D公司)测定B7-1的表达，计数细胞15 000个。2×10⁵个细胞接种60 mm平皿，感染50 MOI的Ad-multigenes病毒后48小时，用SP免疫组化染色法检测p53蛋白的表达。一抗为抗p53鼠抗人单克隆抗体(PAb 1801,Pharmingen公司)。

　　1.5　细胞生长分析

　　3种肝癌细胞系或正常肝细胞系L02，分别以10⁵个数量接种6孔培养板，12小时后分别感染50 MOI的Ad-multigenes或Ad-GFP，培养基做对照，于感染后第1、3、4及6天进行细胞计数，每皿重复计数3次。

　　1.6　细胞凋亡的检测

　　5×10⁵个肝癌细胞分别感染50 MOI的Ad-multigenes，或50 MOI的Ad-GFP，培养基作对照。于感染病毒后的不同时相点，用Phlips 400T透射电镜观察细胞的超微结构改变。按文献〔4〕的方法行TUNEL法检测细胞凋亡。

　　2　结果

　　2.1　肝癌细胞系对腺病毒的感染效率

　　3种肝癌细胞系，给予50 MOI的Ad-GFP时均可达到80%～90%左右的感染效率(见图1)，且随着病毒感染剂量的加大，目的基因的表达水平亦增加，即产生强绿色荧光的细胞数量亦增加。

图1　肝癌细胞系感染携GFP基因的重组腺病毒后的转导效率

　　2.2　目的基因在腺病毒感染肝癌细胞中的表达

　　3种肝癌细胞系分别感染50 MOI的Ad-multigenes后，10⁶个细胞每24小时最高可表达约600 ng的GM-CSF，感染后第3天分泌水平最高，以后逐渐下降，到第11天仍可达数十ng水平(见图2)。IL-2的表达水平低于ELISA试剂盒检测范围的下限(＜16 ng/ml)。用p53免疫组化染色，可见肝癌细胞转导Ad-multigenes后48小时，胞核呈棕色，表明p53蛋白的表达。于转染Ad-multigenes后48小时用流式细胞仪检测，可见肝癌细胞表面B7-1的表达水平明显增加。以大鼠Walker 256细胞作为表达人B7-1蛋白的阴性对照，可见BEL-7402、HepG2细胞均弱表达B7-1分子。转染Ad-p53与未转基因的亲本瘤细胞相比，B7-1的表达水平不增加。以刺激指数表示B7-1的表达水平^〔5〕： 刺激指数＝转基因肝癌细胞的荧光强度/未转基因Walker 256细胞的荧光强度，结果如附表所示，提示随感染腺病毒多基因滴度的加大，B7-1的表达水平亦增加。

图2　肝癌细胞系导入Ad-multigenes后分泌人GM-CSF量

附表　转染Ad-multigenes和Ad-p53后肝癌细胞表达B7-1的水平

　　2.3　细胞生长动力学改变

　　3种肝癌细胞系，感染50 MOI的Ad-multigenes后，与亲本瘤细胞相比，细胞的生长均受不同程度的抑制，而感染50 MOI的对照重组腺病毒载体Ad-GFP，细胞的生长则不受影响。L02正常肝细胞系导入50 MOI的Ad-multigenes或Ad-GFP后，细胞的生长均不受影响。

　　2.4　细胞凋亡的检测

　　肝癌细胞转导50 MOI Ad-multigenes和50 MOI Ad-p53后72小时，在电镜下可见细胞凋亡形态改变： 核膜增厚、染色质边移，出现凋亡小体等，而培养基对照和转导Ad-GFP的肝癌细胞均无此现象(见图3)。TUNEL法原位检测细胞凋亡： 感染Ad-GFP后与细胞对照相似，偶可见凋亡细胞； 当给予50 MOI的Ad-multigenes时，凋亡细胞明显增多。

图3　肝癌细胞系BEL-7402感染腺病毒多基因后72小时电镜观察细胞形态改变　×8 000。左：感染50 MOI的腺病毒-荧光蛋白基因； 右：感染50 MOI的腺病毒—多基因。

　　3　讨论

　　将4种目的基因构建在同一个腺病毒载体的目的是，通过肝癌细胞内转导Ad-multigenes，p53基因起到抑制癌细胞生长，诱导其凋亡的作用。而导入Ad-multigenes的肝癌细胞又可作为瘤苗，通过B7-1、GN-CSF基因而起到免疫增强作用，进一步刺激机体的抗肿瘤免疫反应。GM-CSF、B7-1、IL-2和γ-干扰素(IFN-γ)基因是目前公认的，具有确切瘤苗治疗效果的免疫修饰基因^〔2〕。本实验选择了其中3个，由于IL-2基因未见正常表达，因此起免疫增强作用的主要是B7-1和GM-CSF基因。虽然腺病毒的天然靶宿主是上呼吸道，但本实验证实肝细胞癌及正常肝细胞系L02，均对腺病毒十分易感^〔6〕，50 MOI的病毒量可使近90%的靶细胞受感染。GM-CSF瘤苗在体内发挥生物学作用，其体外GM-CSF的表达水平需至少36 ng/10⁶细胞*24h以上^〔2〕。本实验证实，每10⁶个肝癌细胞经24小时孵育后，可表达约600 ng的GM-CSF，且可持续表达至少11天，这样就为GM-CSF基因的免疫治疗作用奠定了基础。给予50 MOI的Ad-multigenes时，B7-1可在肝癌细胞中表达高于亲本瘤8倍以上。以大鼠Walker 256细胞作为阴性对照，可见未转导多基因的HepG2、BEL-7402细胞均弱表达B7-1分子^〔5〕，当导入腺病毒多基因后，B7-1的表达水平明显增加。感染Ad-multigenes后的肿瘤细胞，可见细胞核中p53蛋白的表达。

　　已有证据显示^〔7，8〕，无论肿瘤细胞p53基因为野生型、突变型或纯合性丢失，当导入野生型p53基因后，肿瘤细胞的生长均受到一定程度的抑制。本实验所选择的3种肝癌细胞系(HepG2含野生型p53抑癌基因^〔7〕)，当导入50 MOI的Ad-multigenes后，其生长均受一定程度的抑制，而感染50 MOI的Ad-GFP却未见此现象。正常的肝细胞系L02感染50 MOI的Ad-multigenes后，其生长却不受影响，说明p53抑癌基因作用的靶细胞是存在DNA损伤的细胞，而对于正常肝细胞则不能发挥抑制作用^〔7〕。电镜观察和TUNEL染色法可见肝癌细胞导入多基因后出现凋亡征象，提示Ad-multigenes抑制肿瘤细胞生长的机理，可能主要是多基因中野生型p53基因诱导肿瘤细胞发生凋亡所致，有待进一步研究。

　　结论： 本实验构建了同时含4种目的基因的重组腺病毒载体Ad-multigenes，证实目的基因p53、B7-1和GM-CSF能在肝癌细胞中高效表达(IL-2不表达)； 导入Ad-multigenes的肝癌细胞，其生长受到一定程度的抑制，并出现细胞凋亡现象。

　　【作者简介】　王征旭(1965年-)，男，辽宁人，医学博士，主治医师，目前在第二军医大学东方肝胆外科医院从事博士后研究，主要研究肝癌基因治疗和细胞信号转导工作。

参　考　文　献

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　　2，王征旭， 何振平， 吴祖泽. 肿瘤基因工程瘤苗研究进展 〔J〕. 国外医学肿瘤学分册， 1998； 25(1)∶1

　　3，王征旭， 何振平， 吴祖泽等. 腺病毒介导多基因在胆管癌细胞中的表达 〔J〕. 第三军医大学学报， 1999； 21(10)∶742

　　4，王征旭， 何振平， 吴祖泽等. 腺病毒介导多基因对胆管癌细胞凋亡的诱导和肝细胞毒性损害 〔J〕. 第三军医大学学报， 1999； 21(11)∶780

　　5，Tatsumi T, Takehara T, Katayama K, et al. Expression of costimulatory molecules B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) on human hepatocellular carcinoma 〔J〕. Hepatology, 1997; 35(4)∶1108

　　6，Zhang WW, Fang X, Mazur W, et al. High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus 〔J〕. Cancer Gene Ther, 1994; 1(1)∶5

　　7，Nielsen LL, Maneval DC. p53 tumor suppressor gene therapy for cancer 〔J〕. Cancer Gene Ther, 1998; 5(1)∶52

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(1999-11-23收稿，2000-08-02修回)