延迟整流性K+通道在人肝癌细胞增殖中的作用
北京医科大学学报 1999年第4期第31卷 论著
作者：傅 卫 周孝思 张宗明 周培爱 吴才宏
单位：傅 卫 周孝思 张宗明 北京医科大学第三医院普通外科，北京 100083；周培爱 吴才宏 北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室
关键词：延迟整流性K+通道☆；癌；肝细胞；代谢；钾通道；内皮生长因子；药理学
摘 要 目的：研究延迟整流性K+通道在人肝癌细胞增殖中的作用。方法：采用膜片钳技术的全细胞记录方式记录人肝癌细胞在不同浓度EGF中延迟整流性K＋通道的跨膜电流。利用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入技术观察EGF和K＋通道阻断剂(TEA)对人肝癌细胞DNA合成的影响。结果：发现表皮生长因子（EGF）促进肝癌细胞增殖的同时使肝癌细胞膜离子通道的跨膜K+电流增加。K+通道阻断剂四乙胺（TEA）能显著抑制EGF促进DNA合成的作用，具有明显的量效关系和时间依赖性，但对细胞的活力无明显影响。结论：人肝癌细胞的增殖活动需要延迟整流性K+通道参与。
中国图书资料分类法分类号 R735.7
The role of delayed rectifier K＋ channel
in the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells
FU Wei＃, ZHOU Xiao-Si , ZHANG Zong-Ming, ZHOU Pei-Ai, WU Cai-Hong
(#Department of General Surgery, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
ABSTRACT Objective: To study the role of the delayed rectifier K+ channel in the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells.Methods: The transmembrane current of human hepatocyte carcinoma cells was recorded by the whole-cell recording technique of patch clamp in different concentration of EGF. The effect of EGF and K＋ channel blocker on the DNA synthesis of human hepatic carcinoma cells was observed by 3H-TdR incorporation technique.Results: EGF promoted the cell proliferatetion of the human hepatocyte carcinoma cells. At the same time, EGF made the K+ channel current of hepatocyte carcinoma cells increased. TEA of K+ channel blocker could significantly inhibited DNA synthesis induced by EGF. There was a linear relationship between the concentration of TEA and the effect of inhibition as well as time-dependence. But TEA didn't reduce the viability of hepatocyte carcinoma cells.Conclusion: K+ channel was necessary for the proliferation of the human hepatocyte carcinoma cells.
MeSH Delayed rectifier K＋ channel☆ Carcinoma hepatocellular/metab Potassium channels
Endothelial growth factor/pharmacol
在淋巴细胞［1］、人的乳癌细胞系MCF-2［2］、人黑色素瘤细胞［3］中各种K+通道与细胞的增殖有关。本实验是在我们发现人肝癌细胞存在延迟整流性K+通道的基础上［4］，研究K+通道在人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖中的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人肝癌细胞系BEL-7402由北京医科大学药学及化学分析中心赠送。
1.2 主要仪器
电极拉制器(Narishige, PP-83, Japan)，EPC-7膜片钳放大器(List, Darmstadt Co., Germany)，5.5.1版PClamp电信号采集程序、数据采集系统(Axon Instrument, Inc., USA)。
1.3 主要试剂
盐酸四乙胺(TEA-Cl),Mg-ATP,KF均为Sigma产品。RPMI1640培养基(Gibco)，EGF(Boehringer Mannheim),3H-TdR(上海原子能研究所)。
1.4 细胞外液和电极液的配制以及玻璃微电极的制备
细胞外液和电极液的配制以及玻璃微电极的制备见参考文献［4］。
1.5 人肝癌细胞系BEL-7402细胞的准备
当细胞在培养瓶中长成单层后，转入35 mm×10 mm的培养皿或培养板中继续培养48 h后,按试验要求在各个培养皿中分别加入一定量的EGF、TEA，或者兼有二者的RPMI1640培养液继续培养24 h。最后以全细胞方式记录细胞的跨膜电流，同时进行细胞计数，测定3H-TdR掺入的cpm值。
1.6 全细胞膜片钳记录
倒置显微镜下,在微操纵器操纵下，进行全细胞膜片钳的记录(室温下)。
1.7 数据处理及统计分析
计量资料以
±s表示，并采用t检验或方差分析进行显著性检验，对二组数据的相关性采用直线回归的方法，对相关系数进行检验。
2 结果
2.1 EGF对肝癌细胞延迟整流性K+通道的影响
不同质量浓度的EGF加入细胞的培养液中培养24 h后，用膜片钳的全细胞记录方式记录细胞的跨膜电流，在钳制电压(holding potential, HP)=－100 mV，测试电压（test potential,TP）=－100～90 mV条件下，不同TP的跨膜电流ITP均增高(表1)。EGF对肝癌细胞膜的延迟整流性K+通道电压门控特性有影响，使跨膜电流增强。
2.2 EGF对肝癌细胞计数的影响
细胞在含有0、1、10、20 μg·L－1 EGF的培养液中分别培养24 h后，细胞计数分别为32±5(×104个，n=4)、35±7(×104个，n=4)、47±7(×104个，n=4)、56±11(×104个，n=4)。表明EGF使细胞数目明显增加，促进细胞的增殖。
2.3 对肝癌细胞活力的影响
在含有10 μg·L－1 EGF的培养液中培养的细胞，分为2组，分别加入终浓度0和20 mmol·L－1 TEA培养24 h后，用4 g·L－1台盼蓝染色进行细胞活力鉴定。TEA组细胞存活率为0.918［279(个)/304(个)］，而未加TEA组为0．946［315(个)/333(个)］，两者差异无显著性(χ2=2.005 3，P=0.156 8)。
2.4 EGF本身和EGF加K+通道阻断剂(TEA)对肝癌细胞DNA合成的影响
2.4.1 EGF本身对肝癌细胞DNA合成的影响 细胞在含有不同质量浓度EGF的培养液中分别培养24 h后，3H-TdR掺入后测定cpm（图1中Without TEA组），EGF明显促进DNA的合成。
表1 不同质量浓度的EGF对人肝癌细胞系BEL-7402
细胞跨膜电流ITP的影响(±s)
Table 1 The effect of different mass concentration of EGF
on the transmembrane current of carcinoma cells
of cell line BEL-7402(±s)I/pA
| TP
(mV) |
ρ(EGF)/μg·L－1 |
| 0(n=12) |
1(n=11) |
10(n=12) |
20(n=9) |
| －100 |
－63±35 |
－64±30 |
－79±22 |
－82±21 |
| －90 |
－46±34 |
－38±25 |
－49±27 |
－39±24 |
| －80 |
－23±37 |
－15±23 |
－9±33 |
6±39 |
| －70 |
－2±42 |
9±31 |
33±29 |
53±60 |
| －60 |
24±45 |
35±42 |
69±34 |
110±78 |
| －50 |
50±49 |
57±53 |
113±42 |
155±92 |
| －40 |
82±63 |
86±66 |
154±47 |
206±101 |
| －30 |
112±80 |
123±81 |
208±42 |
259±112 |
| －20 |
142±92 |
164±96 |
264±47 |
316±125 |
| －10 |
175±110 |
211±114 |
326±55 |
378±128 |
| 0 |
217±124 |
268±131 |
387±67 |
445±134 |
| 10 |
261±143 |
328±146 |
450±78 |
515±139 |
| 20 |
301±166 |
407±154 |
516±88 |
606±130 |
| 30 |
362±179 |
483±164 |
593±95 |
689±128 |
| 40 |
423±195 |
564±182 |
682±108 |
773±123 |
| 50 |
501±210 |
661±192 |
781±129 |
880±122 |
| 60 |
605±217 |
759±204 |
889±138 |
997±138 |
| 70 |
718±230 |
872±233 |
1017±163 |
1150±158 |
| 80 |
838±238 |
887±362 |
1146±171 |
1250±201 |
| 90 |
961±257 |
1128±261 |
1298±217 |
1386±248 |
There was significant difference ,the groups of 10 μg·L－1 and 20 μg·L－1 were compared with the group of 0 μg·L－1 at TP=－70～90 mV level.There was not significant difference,the group of 1 μg·L－1 was compared with the group of 0 μg·L－1 at TP=－100～90 mV level.
2.4.2 10 mmol·L－1的TEA与不同质量浓度的EGF对DNA合成的影响 10 μmol·L－1 TEA与含有不同质量浓度EGF的培养液共同培养细胞24 h后，3H-TdR掺入后测定cpm值（图1）。
2.4.3 不同浓度的TEA与10 μg·L－1的EGF对肝癌细胞DNA合成的影响 在含有10 μg·L－1 EGF的细胞培养基中，再加入0、5、10、20 mmol·L－14种不同浓度的TEA，培养24 h后，进行3H-TdR掺入后测定其cpm值（图2）。
2.4.4 在含有10 μg·L－1 EGF的培养基中培养的肝癌细胞接触TEA(10 mmol·L－1)的时间对DNA合成的影响 用含有10 μg·L－1 EGF的培养液培养肝癌细胞，分别在进行3H-TdR掺入前23、18、12 h和掺入前即刻加入TEA，使终浓度为10 mmol·L－1，然后测定其cpm值（图3）。
* the group of 10 mmol·L－1 TEA was compared with the group of without TEA, P＜0.05; +, the group of 0 μg·L－1 EGF was compared with the group of other EGF concentration, P＜0.05, ++P＜0.01; ρ, mass concentration.
图1 10 mmol·L－1 TEA对肝癌细胞在不同质量浓度的EGF中DNA合成的影响(n=6)
Figure 1 The effect of 10 mmol·L－1 TEA on the liver
carcinoma cells in the different mass concentration of EGF(n=6)
** P＜0.01, compared with 0 mmol·L－1 TEA； ±s in each point was the result of six paralleling samples; c, concentration.
图2 TEA浓度与EGF(10 μg·L－1)中培养的
肝癌细胞DNA合成量的关系(图中每一点为6份平行标本
测定结果的±s)
Figure 2 The relationship of the concentration of EGF
with the DNA synthesis of liver carcinoma cells
in the culture medium (EGF 10 μg·L－1)
3 讨论
Ik在神经、肌肉等可兴奋性组织的细胞中主要起决定动作电位的复极相、动作电位的间期和维持不应期的作用［5］。K+通道在肿瘤细胞中的作用亦有报告，如在人的乳癌细胞系MCF-2中，发现电导为23pS的K＋通道与细胞的增殖密切相关［2］。在人黑色素瘤细胞的研究中同样发现类似神经肌肉细胞的Ik与细胞的增殖有关［3］。
在本实验中EGF能明显使人肝癌细胞系BEL-7402细胞的数目（2.2）和DNA合成增加（图1），而且培养液中的EGF质量浓度愈高，这种作用也愈明显。表明EGF能促进肝癌细胞系BEL-7402细胞的增殖。此外不同质量浓度的EGF使细胞的跨膜电流明显增加（表1）。10、20 μg·L－1 EGF明显改变了人肝癌细胞系BEL-7402细胞Ik的电压门控特性。以上表明EGF在促进细胞增殖的同时，K+通道开放，Ik也增大，提示肝癌细胞增殖的过程中需要K+通道的开放。
* P＜0.05, ** P＜0.01, compared with 0 hour; t, contacting 10 mmol·L－1 TEA time； each point was ±s of six paralleling samples.
图3 细胞在含有10 μg·L－1 EGF的培养基中
与10 mmol·L－1 TEA接触的时间对DNA合成的
影响(图中每一点为6份平行标本测定结果的±s)
Figure 3 The effect of 10 μg·L－1 EGF culture medium
with 10 mmol·L－1 TEA on DNA synthesis of liver
carcinoma cells in at different contacting time
在加入不同质量浓度EGF的培养液中，10 mmol·L－1的K+通道特异性阻断剂TEA都能显著抑制DNA的合成，使3H-TdR掺入的cpm值下降，与未加入TEA的对照组相比差异有显著性（图1），而TEA对细胞的存活率无影响（结果2.3），说明TEA抑制DNA的合成不是由于对细胞的直接毒性作用，而是由于TEA阻断了K+通道。这是本试验中肝癌细胞增殖的同时需要K+通道开放的第2个证据。
在图1的EGF 0 μg·L－1组，TEA的作用不明显，这提示在肝癌细胞的非增殖期间，TEA不直接抑制DNA的合成，而在EGF促进细胞增殖期间，对K+通道开放需求提高后，K+通道阻断剂才减少DNA合成，同时TEA对肝癌细胞无毒性作用。这是本试验中肝癌细胞增殖需要K+通道开放的第3个证据。
TEA的剂量与抑制DNA合成的幅度之间有明显的量效关系（图2），肝癌细胞在含有10 mmol·L－1 EGF的培养液中与10 mmol·L－1 TEA培养的接触时间愈长，EGF促进DNA合成的作用被抑制的程度也愈明显，表明随着与TEA接触时间的增长，抑制DNA合成的作用也增强（图3）。对细胞活力的鉴定，TEA对肝癌细胞增殖的影响非毒性作用（结果2.3），这是本试验中为肝癌细胞的增殖活动需要K+通道开放这一结论提供的第4个试验依据。
EGF是如何影响人肝癌细胞系BEL-7402细胞的K+通道?目前无明确的结论，人肝癌细胞存在EGF受体［6］，EGF与人肝癌细胞系BEL-7402细胞膜上的受体结合后，可能通过蛋白激酶和蛋白质磷酸化系统以及G-蛋白途径影响K+通道，这在可兴奋性细胞中有许多研究［7］。由于延迟整流性K+通道允许Ca2+通过［8］，EGF使K+通道的电压门控特性发生了改变，使Ca2+内流增加，亦即K+通道可能为细胞外Ca2+离子进入细胞内提供了通道。
☆ 自由词。
参考文献
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2 Wangman EA, Young JA, Cook DI.A 23-PS Ca2+-activated K+ channel in MCF-7 human breast carcinoma cells: an apparent correlation of channel incidence proliferation. Pflugers Arch, 1991,417:562-570
3 Lepple-Wienhuesk A, Berweck S, Bohming M, et al. K+ channels and the intracellular calcium signal in melanoma cell proliferation. J Membr Biol, 1996，151:149-157
4 傅 卫，张宗明，周培爱，等.人肝癌细胞膜离子通道特性研究. 北京医科大学学报. 1998，30:115
5 Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels. Neuroscience, 1988，25:729-749
6 徐永华，江万里，彭素芬. 人肝癌细胞株中EGFR的表达和EGF对肝癌细胞生长的促进作用. 实验生物学报, 1989,22:445-453
7 Brown AM. Membrance-delimited cell signaling complexes:direct ion channel regulation by G proteins. J Membrance Biol, 1993,131:93-104
8 Inoue ISAO. Activation-inactivation of potassium channels and development of the potassium channel spile in internally perfused squid giant axon. J Gen Physiol, 1987,78:43-61
（1998-08-26收稿)
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