龙力胶囊对人肝癌细胞诱导分化及机理研究

成都中医药大学学报 2000年第1期第23卷 实验研究

作者：胡兵　安红梅　李新民

单位：胡兵（郴州市第一人民医院，湖南 郴州　423000）；安红梅（成都中医药大学）；李新民（陕西中医学院）

关键词：人肝癌细胞；诱导分化；核机理；龙力胶囊

　　摘　要：　目的：研究中药复方龙力胶囊对人肝癌HCC-9204的诱导分化作用及其机理。方法：用体外培养方法培养HCC-9204细胞，观察龙力胶囊对HCC-9204细胞形态学、集落形成能力、AFP与ALB分泌量、γ-GT活力、核型、细胞周期以及癌基因表达的影响。结果：龙力胶囊能改善HCC-9204细胞的异型性，降低其集落形成能力，降低AFP分泌量及γ-GT活力，提高ALB分泌量，降低细胞染色体主流范围，降低c-myc、c-H-ras基因表达，但对细胞周期影响不大。结论：龙力胶囊具有诱导HCC-9204细胞分化的作用，其机理可能涉及核型良性变及c-myc、c-H-ras降调节。

　　中图分类号：　R735.7;R979.1　　文献标识码：A文章编号：1004-0668(2000)01-0046-03

The Study of Chinese Medicine Compound/DPC Induced Differentiation

　　on Human Heptocarcinoma Cell Lines HCC-9204 and It's Mechanism

HU Bing, AN Hong-mei, LI Xin-min (胡兵,等)

　　The First people Hospital of Chenzhou (Chenzhou，423000，China)

　　ABSTRACT:Objective： To investigate the effects and meachanism of Chinese medicine compound/dragon power capsule (DPC) induced differentiation on human hepatocarcinoma cell lines Hcc-9240. Methods: The present study was carried out by using technique of cell culture in vitro. The effect was observed by monitoring cytomorphology, cloney-forming, the secretion of AFP and ALB,γ-GT activity,chromosome，cell cycle and expression of oncogene. Results:Morphology of HCC-9204 became well-differentiated, growth became slower, cloney-forming was inhibited, the secretion of AFP and γ-GT activity were reduced, the secretion of ALB increased and expression of c-myc. C-H-ras oncogene decreased, the main range of chromosome reduced, but cell cycle did not change markedly. Conclusions: DPC had the effect of induced differentiation on HCC-9204, the mechanism might be related to chromosome and Down Regulation of c-myc. c-H-ras oncogene.

　　KEY WORDS: Human hepatocarcinoma cell line; induced differentiation; nucleus mechanism; Chinese medicine compound/DPC

　　原发性肝癌（以下简称肝癌）一直是肿瘤治疗的堡垒，小肝癌的发现及其手术切除使得肝癌5年生存率一度得以提高^［1］，但与其他实体瘤相比仍处于很低水平，尤其是中晚期无法手术者仍不能得到有效的控制。为此，肿瘤学界正积极探索新的治疗模式，其中之一就是诱导分化治疗。1992年陈惠黎等首次将维甲酸用于肝癌的诱导分化治疗，有效率达30.3%，56%的患者可获病情稳定^［2］，但其毒副作用限制了其临床使用。比较而言，中药具有较少的副作用而且成本低廉，然而目前尚未见到中药复方的相关研究。龙力胶囊（Dragon Power Capsule，DPC）是陕西中医学院李新民教授的临床验方，由苦参、青蒿、鳖甲、丹参等组成，主要用于肝癌的治疗，临床观察取得了较好的成效，既往研究表明其具有多种抗癌活性，并可能具有诱导分化作用。为此，我们选用人肝癌细胞株HCC-9204^［3］对其诱导分化作用作了进一步的研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　中药原液　按原方比例配方，水煎，离心沉淀，除菌，密封，4℃保存。临用前RPMI₁₆₄₀完全培养液稀释成所需浓度。

　　1.2　剂量筛选　改良文献方法^［4］，HCC-9204细胞以1×10⁵/mL接种于96孔培养板，贴壁后以不同浓度梯度中药作用细胞，0.4%胎盘蓝染色，逐日镜下观察细胞变性、坏死及生长抑制情况。选择未出现毒性反应的最大剂量与生长抑制最低有效浓度按等比原则设置大中小3个剂量组，加空白对照组共4组，剂量分别为900 μg/mL、300 μg/mL、100 μg/mL、0 μg/mL（培养液终浓度，相当于生药量），D₁、 D₂、D₃、D₄ 表示。

　　1.3　细胞培养与收获　HCC-9204细胞在含10%胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所产品）RPMI₁₆₄₀(GIBCO产品）中贴壁生长，视生长情况2～3天传代1次。生化实验各组100 mL瓶接种贴壁后加中药，每2天更换、收集培养1次，用于AFP、ALB（白蛋白）检测。细胞常规计数后 PBS洗涤，离心沉淀-20℃保存，用于γ-GT检测。

　　1.4　集落形成实验　常规消化细胞调整浓度，直径30 mm培养皿接种1000个细胞，贴壁后加中药，作用4天后更换新鲜培养液，继续培养1周，肉眼计数每皿集落数，计算集落形成抑制率(＝(对照组集落数—实验组集落数)/对照组集落数)。

　　1.5　细胞爬片制备　按第四军医大学口腔医学院经验方法进行，直径90mm 培养皿内置载玻片，其上接种0.5×10⁴ /mL细胞悬液3～4点，贴壁后加适量含中药完全培养液，4天后弃培养液，PBS洗涤，95%乙醇固定，室温晾干保存备用。

　　1.6　细胞匀浆制备与γ-GT检测　收获细胞悬于pH7.4，0.05M Tris-Hcl缓冲液中，超声粉碎制备细胞匀浆，重氮试剂法检测γ-GT活力，结果换算成mIU/10⁶ cells。1mIU活力定义为在本实验体系中，1分钟γ-GT转化底物γ-L谷氨酰-α-萘胺生成1 μmolα-萘胺的能力。

　　1.7　AFP与ALB检测　收集培养液放射免疫法进行检测，操作按放免试剂盒（试剂盒购自中国原子能研究院同位素研究所）说明进行，结果算成ng/10⁷cells。

　　1.8　染色体标本制备与G显带　25 mL瓶接种培养，中药处理,视培养细胞中期分裂相居多时（约2～3天），加秋水仙素（华美公司产品）（终浓度0.2 μg/ mL），2 h后弃培养液，自制橡皮刮下细胞，0.075M Kcl低渗30 min，甲醇冰醋酸反复固定3次，最后一次过夜，90℃气干，胰酶（Sigma产品）显带，Giemsa染色，镜下计数，分析染色体。

　　1.9　细胞周期检测　25 mL瓶接种培养，中药处理，收获培养第3 天细胞，消化离心，PBS洗涤，调细胞浓度1×10⁶/ mL以上，乙醇固定（终浓度70%），1%Trition-100、0.01RNA酶及0.005%PI处理后，流式细胞仪(Coutter产品)检测，DNA multicycle软件分析，计算各时相细胞百分比。

　　1.10　癌基因表达检测　ABC法进行，细胞爬片0.25% Trition-100温育15 min，PBS洗涤，10%H₂O₂温育10 min，PBS洗涤，c-myc、c-H-ras 单克隆-抗(Oncogene Science产品)（1：200）温育4 h，PBS洗涤，生物素化二抗作用30 min，PBS洗涤，ABC复合物作用30 min，PBS洗涤，0.04%DAB-H2O2显色，苏木素复染，镜下观察。

　　1.11　细胞形态学观察　逐日镜下观察各组细胞生长情况及形态。爬片经苏木素-伊红染色，梯度酒精脱水，透明封片，镜下观察。

　　1.12　数据处理　数据以±s表示，符合方差齐性，正态分布数据作方差分析，q检验；偏态分布数据作H检验；计数资料作χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　细胞形态学　细胞经药物作用后，铺满瓶底速度变缓，部分恢复接触抑制，由对照组的成片成堆生长变为单个或分布稀疏，随药物浓度加大，细胞异型性（atypia）不同程度降低，由长梭型变为多边形、圆形或类圆形，核浓缩而深染。

　　2.2　集落形成实验　各组均有集落形成，随药物浓度加大，集落形成数明显降低(P＜0.05)，集落细胞数明显减少，大中小3 组集落抑制率分别为50.93%、29.9% 和19.08%。见图1。

图一 集落 形成实验结果

　　注：口集落数（X）I标准差（S）

　　n=3（下同）

　　2.3　γ-GT活力　空白组γ-GT活力始终维持在较高水平，呈一定的波动变化，第3天轻度上升，说明细胞从接种到生长稳定尚有一适应过程。各实验组持续下降，第5天最显著，此时细胞正从对数生长期进入缓慢生长期，这种变化可能与细胞生长状态有关。各组差异显著(P＜0.05)。见图2。

图二　DPC对细胞-GT活力影响

　　—●—注D₂组 —△—D₂组

　　—×—D₃组 —○—D₄组

　　2.4　AFP分泌量　各组AFP分泌量均呈波形变化，培养第1天处于较低水平，提示细胞在贴壁过程中较少分泌AFP。第3天达高峰，第5天跌落，第7天略回升，这可能与细胞接种到贴壁，对数生长到缓慢生长过程细胞周期分布不同有关。药物作用后AFP分泌量显著减少（P＜0.05）。见图3。

图三　DPC对细胞AFP分泌量的影响

　　—●—注D₁组 —△—D₂组

　　—×—D₃组 —○—D₄组

　　2.5　ALB分泌量　ALB亦呈波形变化，各组第1天均处于较低水平，提示HCC-9204细胞基本不具备合成ALB能力，细胞经药物作用后均合成、分泌ALB。从第1天到第5天持续上升，第7天回落。这可能与细胞老化有关。各组比较差异显著（P＜0.05）。见图4。

图四　DPC对细胞AFP分泌量的影响

　　—●—注D₁组 —△—D₂组

　　—×—D₃组 —○—D₄组

　　2.6　染色体分析　随机计数50个分散好的中期核分裂相染色体数目，空白组主流范围75～82条，占总数85%，属超三倍体，与建株报告^［3］大致相符。药物作用后，2倍体比例增加，主流范围减少至42～59条，各组均能找见标记染色体M₂(4)t(4;19)(4q^ter→4q11::19p12→19q^ter),M₈del(13)（p^ter→cen→q11:)。

　　2.7　癌基因表达　各爬片背景清晰，着色满意。c-myc蛋白阳性染色呈棕褐色，位于细胞核，呈斑片或颗粒状。c-H-ras蛋白阳性染色呈黄褐色，位于胞膜，由于细胞立体结构的影响，有时可呈胞浆黄染。随药物浓度加大，两种蛋白染色强度逐渐减弱，阳性细胞数减少。

　　2.8　细胞周期分布　细胞经药物作用后，G₀/G₁比例上升，S与G₂+M比例呈下降趋势，无统计学意义（P＞0.05）。提示本实验条件下所用药物浓度可能不影响细胞周期分布。见表1。

表1　各组细胞周期时相分布（%）

　　3　讨论3.1　模型与指标　诱导分化研究始于1971年。Friend首次在实验条件下用二甲基亚砜（DMSO）诱导小鼠红白血病细胞分化并合成原本无法合成的血红蛋白^［5］。 此后，相关研究陆续开展。早在80年代就已证实维甲酸用于急早幼粒白血病疗效优于化疗而副作用相对较少^［6］。 其本质在于抑制恶性表型（Phenotype）并促进分化表型表达，从而使肿瘤细胞向正常细胞方向分化进而达到治疗的目的。因其机理与杀伤性放疗、化疗迥然相异而受到肿瘤界的热切关注。诱导分化早期研究主要集中于白血病细胞，因其有可靠的分化形态标志，后来也常采用肝癌等实体瘤细胞，以其具有良好的恶性标志（AFP、γ-GT）以及特异的分化功能蛋白—白蛋白（ALB）。迄今为止，尚无理想的体内诱导分化模型而主要采用体外培养方法进行研究。人肝癌细胞株HCC-9204系第四军医大学胡川闽等用肝癌手术标本于1992年建株^［3］，建株报告表明其具有分泌AFP的能力。因此，我们选用AFP、γ-GT作为恶性表型指标，ALB作为分化指标。

　　3.2　诱导分化作用　AFP是胎肝、再生肝及肝癌细胞所产生的一种癌胚蛋白，其量的多少反映肝细胞去分化(dedifferentiated)程度的高低；γ-GT主要分布于肝、胰等组织，参与γ-谷氨酰循环，肝癌患者常升至正常人3～100倍，二者均为公认的肝癌肿瘤标志。我们实验结果证明：HCC-9204细胞经DPC（龙力胶囊）作用后，AFP分泌量及γ-GT活力较同时间未作用细胞明显降低，提示DPC能抑制HCC-9204细胞恶性表型表达。

　　ALB是分化肝细胞合成的特异性功能蛋白。我们实验结果显示：HCC-9204细胞基本不具备合成ALB能力。提示其分化程度不高，DPC作用后随浓度大小不同程度恢复了正常肝细胞所具有的合成ALB的能力。集落形成实验是检验培养细胞是否增殖的过硬指标^［7］。HCC-9204细胞经DPC作用后形成集落能力降低，预实验证实所用浓度无细胞毒杀伤作用，因此，集落的减少可能是DPC促分化而增殖能力降低所致；同时，形态学显示药物作用后细胞异型性（atypia）降低。以上实验结果初步显示：DPC具有诱导HCC-9204细胞分化作用。

　　3.3　诱导分化机理　目前研究表明，控制细胞生物学行为的枢纽在细胞核，尤其是基因的表达与调控。因此，我们进一步从细胞核的角度探讨DPC的作用机理。本研究结果表明，DPC能影响HCC-9204细胞核型，特别是染色体倍体，但对细胞周期分布影响不大。研究还发现，HCC-9204细胞染色体主流范围与建株时无明显变化，说明HCC-9204细胞传代至今细胞特性仍然相当稳定。c-myc是myc族细胞原癌基因，表达一种核蛋白，结合DNA参与其他基因的表达调控。c-myc蛋白在增殖细胞中表达较高，随细胞分化而降低同时失去促增殖能力。当其表达降调节（Down regulation）时细胞被诱导向终末分化^［8］。c-H-ras是ras族癌基因，表达_P21蛋白，具有GTP酶活性，作用于下游底物c-Raf蛋白，PKC激酶等把信息传至核内影响其他基因的表达^［9］；其反义RNA能逆转转化细胞的恶性表型^［10］。c-myc蛋白位于核内，_P21位于胞膜，二者常协同作用，通过不同的信息途径或阶段调控细胞的增殖与分化。在人肝癌的研究中已证实二者在参与肝细胞恶性转化过程及肝细胞癌的维持中起至关重要作用^［11］。我们的研究显示：HCC-9204细胞经DPC作用后两种基因的表达均降低，提示DPC对HCC-9204细胞的诱导分化作用可能与c-myc与c-H-ras的降调节有关。

　　5　鸣谢

　　本课题在第四军医大学口腔医学院中心实验室完成过程中，得到生物学教研室吴军正教授及病理学教研室金若教授的大力支持与协助，谨此致以诚挚的谢意！

　　作者简介：胡兵，男，1971年9月生；医学硕士；研究方向：恶性肿瘤的新药开发及中西医结合治疗。

　　 参考文献

　　1，Tang ZY. A new concept on the natural course of hepatocellular carcinoma . Chin Med J 1981,94：585

　　2，陈惠黎. 肝癌诱导分化治疗基础和临床研究. 中国肿瘤,1997,（2）:32

　　3，胡川闽，刘彦仿，隋延仿，等. 人肝癌细胞系HCC-9204的建立及其特性研究.第四军医大学学报,1995,（2）：92

　　4，袁淑兰，黄光琦，王修杰，等.丹参酮和维甲酸对人宫颈癌细胞株的体外诱导分化研究.中华肿瘤杂志,1995,（6）：422

　　5，Friend C，Schor W，Holland J G，et al. Hemoglobin synthesis in murine virus induced Leukemia cells in vitro：stimulatior of erythroid differentiation by dimethyl sulfoxide. Proc Natl. Acad Sci U.S. 1971.68,378

　　6，孙关林.急性早幼粒细胞白血病的诱导分化治疗—44例疗效分析. 中华血液学杂志 ,1989,10（3）：29

　　7，章静波. 细胞生物学实用方法与技术.北京：北京医科大学-协和医科大学联合出版社,1996.53

　　8，Chapekar Ms，Hartman KD，Knode Mt，et al. Synergistit effect of retinonic acid and calcium ionophore A23187 on differentiation，c-myc expression，and membrane tyrosine Kinase activity in human promyelocytic leukemia cell line HL-60. Mol pharmacol ,1986,（2）：140

　　9，张天泽，徐光炜. 肿瘤学（上）.天津：天津科学技术出版社，1996.316

　　10，邓国仁，刘景梅、路桂荣，等. 癌基因c-H-ras反义RNA对细胞恶性表型的逆转作用.中华医学杂志,1989,（6）：361

　　11，Tiniakos D，Spandidos DA ，Kakkanas A ，et al. Expression of ras and ras oncogene in human hepatocellular carcinoma and nonncoplastic Liver tissure. Anticancer Res,1989,(9)：715

（收稿日期：1999-09-14）