健脾理气中药对肝癌端粒酶活性的影响

中国中医基础医学杂志 2000年第1期第6卷 实验研究

作者：孟志强　于尔辛　宋明志　黄雯霞

单位：孟志强（上海医科大学肿瘤医院，上海　200032）；于尔辛（上海医科大学肿瘤医院，上海　200032）；宋明志（上海医科大学肿瘤医院，上海　200032）；黄雯霞（上海医科大学肿瘤医院，上海　200032）

关键词：端粒酶； 中草药； 肝脏肿瘤

　　摘要：目的：在体内和体外观察健脾理气中药对端粒酶活性的影响，探讨其抗肿瘤治疗的作用机制。方法：采用TRAP方法，观察H₂₂肝癌荷瘤小鼠在服用健脾理气中药后肿瘤端粒酶活性的变化，以及健脾理气中药对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721端粒酶活性的影响。结果：体内实验显示中药组端粒酶的活性明显低于对照组(P=0.038)。体外实验表明，健脾理气冲剂对SMMC-7721细胞的端粒酶活性有抑制作用。结论：对肿瘤细胞端粒酶活性的抑制可能是健脾理气中药抗肿瘤作用机制的一部分。

　　中图分类号：R735.705　　文献标识码：B　文章编号：1006-3250(2000)01-0070-03

Inhibition of telomerase activity by JianPiLiQi formula in liver cancer.

Meng zhiqiang　Yu erxin　Song mingzhi　Huang wenxia.

　　（Cancer Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai　200032）

　　Abstract:Objective:JianPiLiQi method is one of important parts in cancer especially the liver cancer clinical treatment process.Telomerase,an RNA-dependent DNA polymerase that used by cancer cells to solve the continued-shorted telomeres caused by end replication question.Therefore the cancer cell achieved an unlimited replicated age by this mechanism but somatic cell not.Activation and up-regulation of telomerase are considered to be an important role in the genesis and development of cancer,and it becomes a hot point in cancer research.The aim is to investigate the anti-cancer mechanism of JianPiLiQi formula by observing the inhibition of telomerase activity in vivo and in vitro.Methods:The JianPiLiQi formula we used in our study is made up of ten Chinese traditional medicines:amyda sinensis,micromelum falcatum,crataegus pinnatifida,codonopsis pilosula,poncirus trifoliata,akebia quinata,oldenlandia diffusa,poria cocos,et al.In vivo,treated with JianPiLiQi formula from the second day after inoculated the HAC mouse liver cancer cell into armpit of mice.The administration of JianPiLiQi formula is 30 g/kg and mice were killed at 14^th day.In vitro,the IC₅₀concentrations in SMMC-7721 human liver cell mensurated by MTT method at third and firth days are 47 mg/ml and 32 mg/ml respectively.The drug concentration we used in cell culture is 40 mg/ml.The culture times are 1,3,5 days and removed drug followed 2 days culture respectively.Telomerase activity detection used Telomeric Repeat amplification Protocol(TRAP)combined with polyacrlamide and agarose gels eletrophresis(PAGE) silver staining.Results:In vivo,JiPiLIQi formula have a 38% cancer inhibition rate,and the cancer telomerase activity in treatment group obvious lower than control (P=0.038)；in vitro,JianPiLiQi formula inhibited telomerase activity in SMMC-7721 liver cancer cell,the inhibited effect is associated with time.The activity of enzyme is no obvious inhibition in first day and medial inhibition in third days,but in firth day the inhibition is obvious.In addition,telomerase activity can resume in some degree when removed drug and followed 2 days culture.Conclusions:Our study showed JianPiLiQi formula is a good method in liver cancer treatment,telomerase activity inhibition should be one part of its anti-cancer mechanisms.And the anti-cancer effect by jianPiLiQi formula is inhibition but not kill.

　　Key words:Telomerase, Liver Carcinoma,Chinese herbs

　　健脾理气方法在肿瘤的治疗尤其是在肝癌的临床治疗中，有着重要的作用，同时也取得了较好的疗效，成为肝癌综合治疗的一部分。端粒(Telomere)是真核动物细胞染色体末端的一个特殊结构，它是由TTAGGG6个碱基的重复序列组成，有稳定染色体的作用，并参与DNA的复制。端粒的重复序列在每次细胞分裂后都要缩短，即所谓的末端复制问题。在缺乏末端复制问题的分子补偿机制的情况下，端粒的不完全复制将传给子代细胞，当端粒的长度缩短到一定程度时，细胞停止分裂进入衰老。而肿瘤细胞能够摆脱衰老的表型变为不死，往往伴随着端粒酶(Telomerase,一种能够在染色体末端合成新的端粒序列的核糖核蛋白)的活化或功能的上调。大多数的研究发现，人类肿瘤含有端粒酶的活化，这些肿瘤缺乏调节端粒酶的机制，不能下调端粒酶的活性使细胞停止分裂和退出细胞周期^［1］。端粒酶在肿瘤的发生发展中有重要的作用，成为现代肿瘤研究的一个新的热点。本文采用TRAP法在体内观察小鼠H₂₂肝癌和体外人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性经健脾理气中药治疗后的变化。

　　方法

　　1　实验材料

　　小鼠H₂₂肝癌细胞株由上海市医药工业研究院提供；人肝癌SMMC-7721细胞株由上医大中山医院中心实验室赠送；昆明种小鼠从上医大实验动物中心购得；所用PCR仪为美国GeneAmp® pCR System 7500；健脾理气冲剂由我院药剂科制备(由白术、山楂、党参、枳壳、八月札、茯苓等10味中药组成，每克冲剂含生药6.37 g。)

　　2　动物实验

　　昆明种小鼠(体重20 g±2 g)20只分为对照组和治疗组(各10只)，取H₂₂小鼠肝癌细胞1.5×10⁶个接种于右腋皮下，接种的当天始以健脾理气冲剂灌胃，每次0.3 ml， 每日2次，相当于生药剂量30 g/kg体重；对照组用生理盐水灌胃0.3 ml/次，每日2次，14d后处死小鼠，摘取瘤块，称重后，生理盐水洗净血液，液氮中保存。

　　3　细胞实验

　　人肝癌SMMC-7721细胞培养于1640培养液(Gibco产品，含10%的小牛血清)。用MTT法测定健脾理气冲剂对细胞的生长抑制率，其3、5d的IC₅₀(50%的细胞抑制率)分别为47 mg/ml和32 mg/ml。在培养时使用40 mg/ml处理细胞。使用前0.25%的胰酶消化计数，取1×10⁶接种于新培养瓶内预培养24h后，换新培养液并加入健脾理气中药(将健脾理气冲剂溶于双蒸水，滤纸过滤2遍，微孔滤膜过滤1遍，高压蒸汽灭菌后，调整药物的pH值至7.2)，使终浓度为40 mg/ml。培养1、3、5d并分别祛除药物再培养2d，计数取7×10⁵细胞，冰冷PBS洗3遍后放置Eppendorf管中,-70℃保存。

　　4　端粒酶的抽提

　　4.1　瘤块的端粒酶抽提

　　将瘤块放入高压消毒的不锈钢液氮研磨筒内磨碎，取80mg～100mg放入Eppendorf管中，加入1×CHAPS裂解缓冲液200μl，冰浴30 min后，14000 g 4℃离心30 min，吸取上清，速冻于-70℃低温冰箱。

　　4.2　细胞的端粒酶提取

　　将收集的细胞中加入1×CHAPS缓冲液200μl，其余步骤同上。

　　5　TRAP分析

　　5.1　采用考马斯亮蓝G-250染色法

　　对抽提的产物进行蛋白定量，将蛋白的浓度稀释至0.5 ug/ul，以便使TRAP分析比较时保持在同一水平。

　　5.2　端粒酶活性测定

　　采用Oncor公司的TRAP-eze^TM端粒酶检测试剂盒。在50μl pCR总反应体积中加入：10×Buffer 5μl，50×dNTP、TS Primer、TRAP primer Mix各1μl、Taq酶2u，端粒酶抽提物2 μl。30℃温育30 min后，按94℃30s，60℃30s程序PCR扩增30个循环。

　　5.3　TRAP产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析

　　将PCR产物25μl进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200V，缓冲液为0.5×TBE，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止，取出凝胶进行银染。步骤：将凝胶在双蒸水中漂洗后，10%乙醇固定10 min，1%硝酸脱色10 min,0.2%硝酸银染色15 min，然后用3%的无水碳酸钠(每升含甲醛1 ml，1%Na₂S₂O₃100μl)显色至所需条带出现而背景不至于过深为至。显色完毕后，用10%乙醇固定，拍照。端粒酶凝胶电泳的阳性结果为有间隔6个碱基对的阶梯状条带的出现。

　　5.4　半定量分析

　　用Alpha Innotech Corporation 的IS1000 Image Analysis System对图像进行半定量分析。将端粒酶含梯状条带的总强度除以内对照条带的强度，得到半定量的数值。

　　6　本文所用统计结果均用SPSS for Windows version 7.5软件分析。

　　结果

　　1　瘤块称重结果显示，中药组重量(0.706 g±0.412 g)明显小于对照组(1.318 g±0.505 g)，P=0.019。

　　2　小鼠瘤块的端粒酶活性测定半定量分析结果经统计分析后显示，健脾理气中药组瘤块的端粒酶活性(0.58)较对照组(1.09)要低(P=0.38)(见图1)。

图1　A为对照组，B为健脾理气中药组。

　　3　体内细胞培养的端粒酶活性测定表明，SMMC-7721细胞在经健脾理气中药40 mg/ml浓度处理的第1d无明显抑制，第3d有中等程度的抑制作用，在祛除药物再培养后酶的活性有较好的恢复；第5d几乎完全抑制，祛除药物后有一定程度的恢复，说明酶活性的抑制强度随药物处理时间的延长而增加(见图2)。

图2　A阳性对照B、C分别第1d和祛除药物再培养2d，D、E分别为第3d和祛除药物再培养2d，F、G分别为第5d和祛除药物再培养2d。

　　讨论

　　原发性肝癌在中国的发病率较高，约占世界总数的40%，其恶性程度高，自然生存期短，明确诊断时大多为中晚期，缺乏有效的治疗方法，总体5年生存率较低。所以综合治疗成为肝癌的主要治疗手段，包括介入治疗、放射治疗、中医药、瘤内酒精注射等。其中中医中药治疗由于症状改善显著，副反应小，全身状态保持较好，病情发展较慢，少数病人AFP可下降，肿瘤亦可缩小或带瘤长期生存等优点，使中医中药在中、晚期肝癌的综合治疗中占有重要地位。而在中药治疗中，于尔辛教授创立健脾理气又是效果较为理想的方法，健脾理气中药配合外放射可使5年生存率达到43%^［2］。上海医科大学肿瘤医院对健脾理气中药的实验研究证明：能调节免疫功能抑制肿瘤生长，对二乙基亚硝胺诱发的肝癌前病变及乙雌酚诱发的肝肿瘤具有延缓和治疗作用，能降低HBV转基因小鼠血清AFB1-白蛋白加成物的水平，抑制N-ras基因的过量表达等。

　　端粒酶在正常的体细胞内无活性，而恶性肿瘤组织由于缺乏调节端粒酶的机制，而使得肿瘤细胞有无限增殖的能力。因此，如何调节该酶的活性成为治疗肿瘤的一个新的探索途径。端粒酶的特性使端粒酶活性的测定在肿瘤研究中显得极为重要。本文采用端粒酶活性的测定方法为Kim等^［3］在1994年建立的TRAP方法，该方法有灵敏度高，能够进行半定量分析的优点，在端粒酶研究中广泛应用。本研究的结果显示，在体内动物实验，健脾理气方对荷瘤小鼠的肿瘤细胞的端粒酶活性有下调的作用，同时为肿瘤抑制率38%，说明肿瘤的抑制与端粒酶活性的下调有关。国外相似的研究说明，化疗对体内肿瘤的端粒酶活性有抑制作用^［4］。体外的实验结果说明，健脾理气中药对肿瘤细胞的作用主要是抑制，而不是直接杀伤，因为在药物从培养液中祛除再培养后肿瘤细胞端粒酶的活性能够有一定程度的恢复。这个结果与该方的组方原则是相同的，因为我们所用的健脾理气方主要为调补的药物，不是以攻伐为主。这也是健脾理气中药副作用小的原因之一。

　　本研究工作亦表明，健脾理气中药有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用(资料尚未发表)，因为端粒酶活性和bcl-2,p53等凋亡相关基因有关^［5、6］。因此，健脾理气方对肿瘤的抑制作用与端粒酶活性的调节以及凋亡有关。但是端粒酶活性的降低是凋亡的原因还是结果，尚不能明确，有待进一步研究。

　　作者简介：孟志强(1970-)，男，上海医科大学肿瘤医院主治医师，医学博士，从事肝癌的中西医结合治疗。

　　参考文献

　　［1］Kim nW.Clinical implications of telomerase in cancer.Eur J Cancer,1997,33(5):781-6.

　　［2］于尔辛.中医治疗肝癌的科学基础.见：汤钊猷，杨秉辉主编.原发性肝癌的研究与进展.上海：上海医科大学出版社，1990：302.

　　［3］Kim NW,Piatuszek MA,Prowse KP,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266(23):2011-5.

　　［4］Axel Hoos,Hedwig H.Hepp,Sepp Kaul,et al.Telomerase activity correlates with tumor aggressiveness and reflects therapy effect in breast cancer.Int J cancer,1998,79(1):8-12.

　　［5］Manda m,Kumar R.Bcl-2 modulates telomerase activity.J Biol chem,1997,272(22):14183-7.

　　［6］Maxwell SA,Capp D,Acosta SA.Telomerase activity in immortalized endothelial cells undergoing p53-mediated apoptosis.Biochem Biophys Res commun,1997,241(3):642-5.

收稿日期：1999-08-01修回日期：1999-09-16