诱导肝癌分化药物的研究进展

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第5期Vol.26No.51999

章雄文　胥彬

　　 关键词：肝癌 分化诱导药物 癌细胞再分化 诱导分化治疗

　　肿瘤化疗的传统着眼点是癌细胞的杀伤，认为“一旦成为癌细胞，永远就是癌细胞”。直至70年代，先后发现8－溴cAMP、双丁酰cAMP、二甲基亚砜（DMSO）、维甲酸（RA）等可使某些肿瘤细胞的一些恶性表型逆转和再分化。所谓癌细胞的再分化（redifferentiation）是指在分化诱导剂的存在下，恶性肿瘤细胞的形态、生物学或生物化学方面的诸多标志均向正常细胞的方向演化分化，甚至完全转变成正常细胞。目前，恶性肿瘤的诱导分化治疗已成为肿瘤生物学和肿瘤治疗学的研究热点和前沿领域，应用全反式维甲酸（ATRA）治疗人急性早幼粒细胞白血病已获得显著疗效，使诱导分化作为恶性肿瘤的一种新型治疗方法日益引起医学工作者的关注和兴趣。相比而言，包括肝癌在内的实体瘤的诱导分化研究尚处于体外实验阶段，但也取得了可喜的成果，从天然产物、合成化合物及基因治疗药物中寻找新的分化诱导剂的工作正不断取得进展，本文对肝癌的分化诱导药物研究进展作一综述。

　　1　维生素甲类化合物（retinoids）

　　是维生素甲一大类化合物的总称。维生素甲（视黄醇，retinol）必须在细胞内转变为维甲酸（视黄酸，retinoicacid,RA）后才表现诱导分化作用。天然的RA为全反式RA(all－trans－retinoic acid,ATRA)，除对白血病具有很好的诱导分化治疗作用外，对肝癌细胞株SMMC－7721亦有显著的诱导分化作用。生物学和形态学方面的研究表明，SMMC－7721细胞经ATRA10μmol/L处理后，生长受到抑制，G₀/G₁期细胞增多，G₂＋M、S期细胞减少，细胞形态向正常肝细胞方向逆转，核变小，胞浆增多，线粒体和内质网增多，细胞染色体主流范围由对照细胞的48～56条下降至44～50条，其中二倍体细胞数由4％上升至15％^[1]。生物化学方面的研究发现，ATRA可降低SMMC－7721细胞的甲胎蛋白（AFP）分泌量和γ－谷氨酰转肽酶（γ－GT）活性，升高碱性磷酸酶（ALP）和酪氨酸转氨酶（TAT）活性，增加白蛋白（ALB）的分泌量^[2～4]。AFP和γ－GT是两个公认的人类肝癌的标志物，而ALP和TAT只有在成熟分化的肝细胞中才有，是肝细胞成熟分化的标志。ALB是成熟肝细胞分泌的蛋白，亦为肝细胞分化标志之一。这些研究结果在体外细胞培养水平上证明了ATRA对SMMC－7721细胞诸多恶性表型的逆转作用，不仅如此，ATRA在体内还可阻断或延缓肝癌的发展。用二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌后，肝中增殖指标γ－GT、谷胱甘肽S－转移酶（GST）、胞液和膜性TPK逐步升高，而作为分化标志的精氨酸酶（AGN）则明显降低，如在诱癌的同时给予ATRA，则可延缓γ－GT、GST和两种TPK的升高及AGN的降低，此种作用并非ATRA本身对酶活力的影响，而是ATRA阻断肝癌发展的结果^[5]。

　　ATRA对肝癌细胞诱导分化的作用机制同细胞膜糖复合物改变、蛋白激酶及癌基因表达的改变有关^[6]。研究发现，ATRA可改变SMMC－7721细胞表面糖链的异常结构，使其向正常结构的方向转化，糖链结构的改变又直接影响细胞的恶性行为，很可能与接触抑制的恢复有关。衣霉素是一种专一性糖蛋白N－糖链合成抑制剂，可拮抗ATRA使F9细胞的分化，说明ATRA至少有一部分作用是通过糖蛋白糖链的正常合成来完成的。cAMP或其类似物对人肝癌细胞亦有明显的促分化作用（见下），其生物效应主要是通过cAMP依赖性蛋白激酶（蛋白激酶A,PKA）起作用的；PKC是佛波酯（TPA）受体，与多种促癌剂有关；TPK膜性蛋白组分是多种生长因子受体的一部分，是反映肝癌细胞分化的最佳蛋白激酶指标。ATRA在诱导SMMC－7721细胞分化时，胞浆中PKA活力在早期（1～3d）明显增加，胞浆及膜性组织中PKC和TPK则明显降低，而在化学诱发肝癌时PKC和TPK则逐步增高，提示肝脏反分化时和诱导重分化时蛋白激酶有相当的变化，说明蛋白激酶与细胞分化的机理有关。肝癌细胞恶性表型的出现与某些过量表达的癌基因有密切关系，c－fms和IGF－II基因都是和生长因子及其受体有关的基因，ATRA可使SMMC－7721细胞c－fms和IGF－II基因的表达减少，与肝癌细胞诱导分化的逐步增加相一致，表明抑制生长因子及其受体的表达是ATRA诱导分化的作用机制之一^[7]。N－ras基因的编码蛋白p21是一种GTP结合蛋白，能激活磷脂酶C，进而活化PKC通路，ATRA可在3h内使SMMC－7721细胞的N－ras转录和p21蛋白表达明显降低^[8]，推测ATRA可能首先和细胞浆受体视黄酸结合蛋白（CRABP）形成复合物，进入细胞核，作用于基因转录，抑制癌基因表达，使p21减少，然后通过抑制磷脂酶C而使PKC活力下降。

　　ATRA的同分异构体13－顺维甲酸（异视黄酸，13－cis－retinoicacid,13c－RA,IRA）毒性较ATRA小，对SMMC－7721细胞的诱导分化与ATRA相似^[9]。10μmol/LIRA作用8天，可使SMMC－7721细胞AFP生成减少，γ－GT活性逐日下降，TAT明显增加。肿瘤细胞之间的接触抑制消失与细胞表面纤维连接蛋白(Fn)的减少有关，IRA作用4天，SMMC－7721细胞表面Fn增高至对照细胞的6.7～8.2倍，提示IRA的诱导分化作用与细胞接触抑制的恢复有关。

　　2　环磷酸腺苷（cAMP）衍生物

　　cAMP是一种细胞内的媒介物，是一种重要的细胞内信号分子，也是某些癌细胞的内源性分化诱导剂。cAMP在细胞内可被磷酸二酯酶迅速水解为5′－AMP，因此，人们合成了不少cAMP衍生物以期发现一些有用的药物。研究发现，8－溴代环磷酸腺苷（8Br－cAMP）对人肝癌细胞株SMMC－7721具有分化诱导作用，8Br－cAMP0.5mmol/L可明显抑制SMMC－7721细胞的增殖，降低γ－GT比活力和升高ALP的比活力，降低膜性组分中的TPK比活力^[8]。

　　另一cAMP衍生物双丁酰环核苷酸（db－cAMP）是一较稳定的化合物，可使肝癌细胞表面的N－糖链结构发生变化，使二天线结构增多，三、四天线结构减少，未成熟的高甘露糖型链和核心岩藻糖也减少，表明db－cAMP可使细胞表面糖链结构趋向正常化^[10]。

　　3　联苯双酯（DDB）

　　DDB为治疗慢性肝炎药物，对小鼠H₂₂腹水型肝癌有一定疗效。DDB10^－4mol/L可明显抑制人肝癌Bel－7402细胞AFP基因的表达，降低AFP分泌量和γ－GT活力，升高ALB分泌量和TAT活性，表明DDB能诱导人Bel－7402肝癌细胞的分化。DDB的诱导分化作用同其降低Bel－7402细胞c－myc基因表达，诱导抑癌基因p53的表达有关，c－myc癌基因表达在增殖和分化过程中起重要作用，其表达的降低可诱导细胞分化，而抑癌基因p53具有诱导终末分化，调控生长的功能。DDB还能明显升高Bel－7402细胞cAMP含量，提示此作用亦是其分化作用的机制之一^[11]。

　　4　氧代赖氨酸（L－4－oxalysine,OXL）

　　OXL是我所从辽宁省大连地区土壤中分离得到的新种玫瑰绿褐链霉菌所产生的一种碱性氨基酸类抗生素，具有肝脏保护作用^[13]，对包括H₂₂实体型肝癌在内的多种小鼠动物移植性肿瘤有明显抑制作用^[13]。我们实验室以往的研究表明，OXL可抑制人肝癌Bel－7402细胞AFP基因的表达及AFP分泌量并逆转AFP对荷H₂₂小鼠的免疫抑制作用^[14]。新近的研究发现，OXL对体外培养的人肝癌HepG2、Bel－7402和Bel－7404细胞生长有抑制作用，可使HepG2细胞的AFP分泌量下降，对裸小鼠异种移植人HCC－93实体型肝癌的生长有明显抑制作用，并明显抑制HCC－93肝癌的AFP分泌量和γ－GT活力（待发表资料），提示OXL的抗肝癌作用与其逆转肝癌恶性表型作用有关，值得进一步探讨。

　　5　羟基喜树碱（10－hydroxycamptothecin,HCPT）

　　HCPT是从中国喜树中分离而得到的具有抗肿瘤作用的生物碱，具有抗瘤谱广、作用强、毒性低等特点。HCPT抗癌机理除了公认的选择性抑制DNA拓扑异构酶I(TopoI)机制外，低剂量（0.001～0.01μmol/L）HCPT处理3天，可诱导25％的HL－60细胞形态分化^[15]。我们实验室的研究发现，HCPT可诱导白血病U937、K562和HL－60细胞分化（待发表资料）。进一步的研究表明，HCPT对体外培养的三株人肝癌细胞具有明显的生长抑制作用，并可逆转人肝癌HepG2细胞某些生物学的恶性表型。HCPT0.005μg/ml作用不同时间，可明显降低HepG2细胞AFP分泌量和γ－GT活力，升高ALB的分泌量和ALP活力。流式细胞术测定显示，HCPT可使HepG2细胞阻滞于G2/M期（待发表资料）。HCPT诱导分化作用的机制尚未完全阐明，Ling等^[15]的研究发现，经HCPT和DMSO诱导成熟的HL－60细胞的TopoI活性低于对照组细胞，提示HCPT的诱导分化作用与其对细胞TopoI的抑制作用有关。

　　6　反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides,ASO）

　　肿瘤细胞恶性表型的出现与某些过量表达的癌基因有密切关系，原发性肝癌（PHC）中至少有6种癌基因的活化和过量表达。应用ASO技术，把与某一特异癌基因互补的DNA或RNA分子导入靶细胞，导致mRNA－DNA或mRNA－RNA杂交链形成，以抑制或封闭该基因的过度表达，能达到抑制肝癌细胞生长，逆转肝癌细胞恶性表型的基因治疗效果。以脂质体包裹反义胰岛素样生长因子－I(IGF－I)基因转染的人肝癌HepG2细胞，其分泌AFP和癌胚抗原（CEA）水平显著低于亲本细胞，预示阳性克隆细胞的恶性程度低于亲本细胞，细胞内原有的生物学过程发生改变^[16]。黄贤明等构建了一个能表达c－est－2、c－myc及N－ras三个癌基因联合反义RNA的重组逆转录病毒载体，并成功地感染了人肝癌细胞株SMMC－7721，使其在转化细胞中表达联合反义RNA，使SMMC－7721细胞生长速率下降约70％，软琼脂集落形成能力和裸鼠致瘤能力显著下降，表明三个癌基因联合反义RNA显著地抑制了肝癌细胞SMMC－7721的恶性表型^[17]。p21^WAF1/CIP1基因的表达产物p21蛋白可以引起多种肿瘤细胞的生长抑制，将外源性p21^WAF1/CIP1通过逆转录病毒载体转染到人肝癌HCC－9204细胞株，使得p21^WAF1/CIP1过表达，不仅可使肝癌细胞生长停滞，并可使细胞的恶性表型发生逆转，转染的肝癌细胞在软琼脂中无集落形成，5－溴－2′脱氧脲嘧啶(BrdU)的掺入量显著降低，G1期细胞增多，S期细胞减少^[18]。

　　7　丹参酮

　　丹参酮是从活血化瘀中药丹参中提取的有效成分，对多种癌细胞具有细胞毒杀伤作用，对宫颈癌细胞有诱导分化作用^[19]。对人肝癌SMMC－7721细胞的研究发现，丹参酮可使SMMC－7721细胞形态趋向正常分化，细胞生长明显受抑，BrdU标记率和增殖细胞核抗原(PCNA)阳性率明显降低，细胞被阻止于G₀/G₁期，S期细胞数量明显减少。BrdU为胸腺嘧啶类似物，可掺入增殖细胞DNA，反映整体细胞的DNA合成能力，PCNA是DNA多聚酶δ的辅助蛋白，直接参与细胞增殖过程中的DNA复制。BrdU标记率和PCNA阳性率是反映细胞增殖能力的可靠指标，二者的降低表明药物具有抑制细胞生长，诱导细胞分化的作用。丹参酮的诱导分化作用同其影响癌基因的表达有关，流式细胞仪分析结果显示，丹参酮可抑制SMMC－7721细胞的c－myc癌基因表达，却使c－fos癌基因表达明显增加，推测丹参酮可能通过影响肝癌基因的表达，抑制DNA多聚酶δ的活性和PCNA表达，抑制细胞进入S期及DNA合成，从而抑制细胞生长增殖，诱导SMMC－7721细胞分化^[20]。

　　8　人参

　　人参是传统中药中的“上药”，其滋补及免疫调节作用已为人们所公认。近年来对人参抗肿瘤的药理研究发表了不少文章，人参皂甙在体外对肿瘤细胞有直接杀伤作用，其抗肿瘤的机制比较复杂，Odashima等^[21]发现，人参根总甙可使MH₁C₁大鼠肝癌细胞向正常肝细胞方向逆转。人参皂甙可抑制肝癌细胞的软琼脂克隆形成率，而且肝癌细胞的生化代谢出现接近于正常细胞的改变，使L－³H－鸟氨酸合成增加，琥珀酸－细胞色素C还原酶活性增加。Abe等^[22]的进一步研究发现，人参在使肝癌细胞发生上述生化学逆转时，在超微结构的形态学上也出现向正常肝细胞逆转的改变。人参皂甙100μg/ml作用170天，肝癌细胞的线粒体数量增加、体积增大、分布规律。这些生化学和形态学方面的变化，都是人参皂甙使肝癌细胞发生逆转的有力证明。

　　9　亚硒酸钠（Na₂SeO₃）

　　微量元素硒是机体正常生长的必需营养素，能调控细胞增殖酶和分化酶活性，具有恶性表型的逆转作用。体外研究发现，Na₂SeO₃可抑制SMMC－7721细胞的生长，选用其生长抑制率为35％的最小有效剂量2.5μmol/L处理SMMC－7721细胞，对细胞³H－TdR的掺入和AFP的分泌均有抑制作用，并可增加细胞表面的Fn含量和分泌到培养液中的Fn量，提示Na₂SeO₃可诱导Fn的合成，恢复细胞接触抑制，逆转SMMC－7721细胞的某些恶性表型^[23]。此种作用与1μmol/LATRA的作用几乎相等，当二者合用时，对SMMC－7721细胞某些表型的逆转存在着加和作用^[24]。

　　10　地塞米松

　　谭湘陵等^[25]在无血清培养条件下，观察了1.0μg/ml地塞米松对人肝癌细胞株SMMC－7721的诱导分化作用，发现地塞米松可使细胞贴壁更加牢固，形态由长梭形为主转变为以多边形为主，PHA诱导凝集程度大幅度下降，核仁组成区嗜银蛋白胶质银染（Ag－aNOR）明显萎缩消失。Ag－aNOR是28S、18S、5.8Sr－RNA基因所在的位置，其表达高低与细胞的分裂能力呈正相关，与细胞的分化程度呈负相关。台盼蓝测定诱导前后的活细胞比例无统计差异，表明地塞米松的作用并非是抑制或杀灭细胞而致Ag－aNOR的萎缩，推测地塞米松的诱导分化可能与其对基因（特别是rRNA基因）的调节有关系。

　　11　低温冻存和冷冻治疗

　　低温冻存和冷冻治疗是肿瘤研究和治疗的重要手段，实验结果表明，－50℃冻存复温后恢复培养的SMMC－7721细胞的有丝分裂率下降，经－50℃多次冻存后，该细胞株染色体主流范围有向正常人二倍体细胞染色体转变的趋势，乳酸脱氢酶（LDH）同工酶由原来典型的肝癌细胞趋向H型为主的分布转变成为以M型为主的分布（正常人肝细胞LDH同工酶含量分布为M型），提示－50℃冻存可使SMMC－7721细胞的恶性表型发生改变，对SMMC－7721细胞可能有诱导分化作用^[26]。

　　肝癌实体瘤诱导分化的研究虽然起步不久，但作为肿瘤分子生物学中的一个崭新领域，已日益受到各方面的重视。随着相关学科和技术的发展、对诱导分化机理的进一步阐明及临床实践的进一步发展，肝癌的诱导分化治疗必将从实验室的研究转向指导临床应用，为肿瘤的防治作出更大的贡献。

　　作者单位：中国科学院上海药物研究所（上海市200031）

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(杨红欣　校对)

　　(1998－07－23收稿)