细胞融合大鼠肝癌疫苗制备及免疫相关表型分析

　　中国肿瘤临床1999年第22卷第3期

卫立辛　钱卫珠　闫振林　王皓　刘彦君　罗明　赵健　施军霞　沈锋　吴孟超　郭亚军

　　 摘要　目的：制备大鼠BERH－2肝癌细胞和激活B细胞融合肿瘤疫苗并观察其免疫相关表型，为融合肿瘤疫苗应用人体提供依据。方法：应用PEG在不同条件下，将肝癌细胞与激活B细胞融合。流式细胞仪鉴定融合细胞比例和检测MHC－I/II、B7、ICAM－1、LFA－1的水平。结果：50％PEG－1400介导细胞融合60秒获得融合细胞百分比最高。与融合前BERH－2细胞相比，融合细胞获得了MHC－II、B7、ICAM－1、LFA－1的表达，MHC－I表达增加。结论：制备大鼠BERH－2肝癌细胞和激活B细胞融合肿瘤疫苗的最佳条件为50％PEG－1400融合60秒。融合细胞不但表达肿瘤抗原，同时表达免疫原性相关分子。

　　关键词：融合疫苗肝癌

　　 恶性肿瘤疫苗的研制是肿瘤免疫治疗研究的热点之一。目前研究主要策略是对肿瘤细胞进行修饰或改造，提高肿瘤细胞免疫原性并能有效的呈递呈，从而能激活机体免疫细胞，达到抑制或杀伤机体内肿瘤细胞^[1]。激活B细胞表达MHC分子和辅助刺激分子，具有抗原呈递能力，将肿瘤细胞和激活B细胞融合，可望得到的融合细胞不但表达有肿瘤特异抗原，同时还表达共刺激分子，并能使肿瘤抗原有效的呈递^[2]。本文应用PEG将大鼠BERH－2肝癌细胞与激活B细胞融合，并初步观察了融合前后免疫相关的表型变化。

　　1　材料与方法

　　1.1　BERH－2大鼠肝癌细胞^[3]

　　来源于化学诱发的Wistar大鼠肝细胞癌，生长迅速，可在同种系动物肝脏内长成实体瘤。

　　1.2　B细胞的激活

　　将牛血清白蛋白与Freund′s完全佐剂混合后免疫大鼠，14天后可从其脾脏中分离获得激活的B细胞。

　　1.3　细胞融合

　　将BERH－2细胞与激活的B淋巴细胞以1∶10的比例在含有50％不同分子量PEG－1400，1500，2000，4000的无Ca^2＋及Mg^2＋的Dulbecco′sPBS中融合不同时间(30秒，45秒，60秒，75秒，90秒)，以兔抗BERH－2血清及兔抗大鼠B细胞血清先后对融合后的细胞进行染色，流式细胞仪(FACScan,BD公司)检测双阳性细胞为融合细胞。

　　1.4　免疫相关表型检测

　　细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，以抗大鼠MHC－Ⅰ单抗（OX－18）、MHC－Ⅱ单抗（OX－6），ICAM－1（IA－29）单抗及LFA－1（WT.1）单抗染色。以CTLA4－Ig对B7染色，该分子为将CTLA4的可变区与人IgG1的绞链区、CH2、CH3重组构成的可溶性嵌合蛋白。以小鼠抗人CD3（GH3,IgG2b）及人可溶性CD44－Ig嵌合蛋白作为阴性对照。细胞与单抗或融合蛋白混合冰浴30分钟后，洗涤3遍，以FITC标记的羊抗鼠Ig或兔抗人Ig抗体与细胞混合再次冰浴30分钟。将细胞洗涤、固定后以流式细胞仪进行分析。

　　2　结果

　　2.1　融合细胞的条件

　　将融合时间确定在60秒，测定不同分子量PEG对融合率的影响。结果表明融合细胞百分比在采用50％PEG－1400的情况下最高。将PEG分子量确定在1400，测定不同融合时间对融合率的影响。结果表明融合细胞百分比在融合时间为60秒时融合率最高。50％PEG－1400，作用60秒是BERH－2与激活的B淋巴细胞进行融合的最佳条件。

　　2.2　融合细胞的表型改变

　　亲代BERH－2细胞表达少量的MHCⅠ类抗原和少量的细胞间粘附分子1(ICAM－1)，但缺乏MHCⅡ类抗原、淋巴细胞功能抗原1(LFA－1)及共刺激分子B7。相反，BERH－2－B融合细胞系表达MHCⅡ类抗原、ICAM－1、LFA－1和B7(附图)，MHCⅠ类抗原的表达增加。

附图　BERH－2细胞、激活的B细胞及BERH－2－B融合细胞免疫相关表型分析A.

　　肝癌BERH－2；B.激活B淋巴细胞；C.BERH－2－B融合细胞

　　2.3　融合细胞的致瘤性测定

　　10只肝内注射了2×10⁶个亲代的BERH－2细胞的大鼠均生长肿瘤并在60天内死亡。相反，10只注射了同样数目的BERH－2－B融合细胞的大鼠均无瘤生存180天。经检测，所有的4株融合细胞系注射同种大鼠均无致瘤性。

　　3　讨论

　　机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切的关系。正常机体每天有许多细胞可能发生突变，但并不一定都发展为肿瘤，其机制主要是因为机体通过细胞免疫机制能识别并特异性的杀伤突变细胞，使突变细胞在未形成肿瘤前即被清除。但当突变细胞逃避了机体的免疫监控后，机体滋生肿瘤。机体抗肿瘤细胞免疫主要取决于两个信号系统的完整性^[4]。肿瘤细胞一般具有肿瘤特异性抗原，当这种抗原在肿瘤细胞内和MHC分子结合以MHC－肽复合物的形式表达在细胞表面后^[5,6]，T细胞受体（TCR)和CD₈/CD₄能与该MHC－肽复合物结合形成第一信号系统。有时第一信号系统并不能有效完成T细胞识别肿瘤抗原，还需辅以共刺激信号（又称第二信号），共刺激信号主要由细胞表面粘附蛋白受体配体系统等分子组成，其中肿瘤细胞表面B7、ICAM和T细胞表面CD₂₈、LFA－1是两对最主要的第二信号系统^[7,8]。当机体对上述肿瘤抗原识别的信号系统不完善，如MHC分子、B7、ICAM、CD₂₈和LFA－1等中的一种或几种减少甚至缺如时，机体不能实现有效的免疫监控，肿瘤得以发生发展。增强机体的抗肿瘤细胞免疫功能是当前肿瘤治疗的研究策略之一。根据不同肿瘤细胞逃避免疫监控机制的不同，通常以细胞因子基因导入肿瘤细胞，如将参与第一或第二信号系统传递的相关分子基因导入低表达或不表达相应组分的肿瘤细胞，随后将这种经修饰的细胞回输到体内，这种细胞能在体内外刺激宿主的T淋巴细胞产生特异性的免疫反应杀灭这些经过修饰的肿瘤细胞，而且对未修饰的肿瘤细胞也能产生特异性的杀伤，因而被称之为肿瘤疫苗。然而，基因修饰法制备肿瘤疫苗不仅费时，而且需攻克许多技术上的难题，还尚需提高基因转染效率和转染的靶向性，另外，肿瘤细胞常为多基因缺陷，而基因修饰的疫苗常为单基因修饰肿瘤细胞，因而基因修饰的疫苗不能成为有效的多基因缺陷肿瘤的疫苗。

　　本实验室尝试以肿瘤细胞和激活的B细胞融合的方法制备肿瘤疫苗^[9]。这种细胞融合来源的疫苗不仅从肿瘤细胞获得特异性肿瘤抗原，而且从激活的B细胞获得了充足的各种共刺激分子和MHC抗原，以这种疫苗回输机体，能增强机体的抗肿瘤免疫。激活B细胞具有抗原递呈能力，近年来应用抗原递呈细胞(APC)制备肿瘤疫苗倍受重视^[10]。本实验应用PEG，在不同条件下，将大鼠肝癌细胞系BERH－2与激活的B细胞融合，摸索到最佳融合条件是以50％PEG－1400融合60秒，与融合前细胞免疫相关表型相比，证实融合细胞的MHCI表达增加，MHCII、ICAM－1、LFA－1和B7获得表达。该实验不仅为进一步观察细胞融合疫苗在体内的作用及机理提供了实验基础，同时为细胞融合法制备人肿瘤疫苗提供了实验依据。

　　*本文课题为国家自然科学基金重点课题资助项目(批准号39789010)

　　国家杰出青年科学基金(批准号39725028)上海市卫生局医学领先学科资助项目

　　作者单位：卫立辛　钱卫珠　闫振林　罗明　　施军霞　沈锋　吴孟超　第二军医大学东方肝胆

　　外科医院肿瘤免疫和基因治疗中心(上海市200438)

　　王 皓　刘彦君　赵健　郭亚军　Sidney Kimmel Cancer Center ,10835

　　Altman Row ,San Diego ,CA92121,USA

　　参考文献

　　1 Cayeu XS, Richeer G, Noffz G, et al. Influence of gene－ modified(IL－ 7,IL－ 4,and B7) tumor cell vaccines on tumor antigen presentation. J Immunol, 1997;158:2834

　　2 Schoenberger SP, Jonges LE, Mooijaart RJ, et al. Efficient direct priming of tumor－ specific cytotoxic T lymphocyte in vivo by an engineered APC. Cancer Res, 1998;58:3094

　　3 郭亚军 ,吴 孟超,陈汉,等.大鼠BERH－2肝癌模型的复制及其在肿瘤免疫学研究中的应用.中华实验外科杂志,1989;6:68～70

　　4 Doyle C, Strominger JL. Interaction between CD4 and class II MHC molecules mediated cell adhesion. Nature,1988;330:256

　　5 Chen LP, McGowan P, Ashe S,et al.Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell－ mediated tumor immunity. J Exp Med, 1994;179:523

　　6 Townsend SE,Allison JP. Tumor rejection after direct costimulation of CD8^＋ T cells by B7－ transfected melanoma cells. Science, 1993;259: 268

　　7 Norment AM, Salter RD, Parham P, et al.Cell－ cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature, 1988;336:79

　　8 Linsley PS, Lebtter JA. The role of the CD28 receptor during T cell response to antigen. Annu Rev Immunol, 1992;11:191

　　9 Guo YJ, Wu MC, Chen H,et al.Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994;263:518

　　10 Chakraborty NG, Sporn JR, Tortora AF, et al. Immunization with a tumor cell lysate loaded antologous antigen presenting cell based vaccine in melanoma. Cancer Immunol Immunother, 1998;47:58