大鼠肝癌发生期间细胞增殖与凋亡关系初探
癌症 1999年第5期第18卷 快速报道
作者：韦伟 龚建平 裘法祖
单位：韦伟，深圳市中心医院外科/分子医学中心(深圳518036)；龚建平 裘法祖，武汉同济医院外科/分子医学中心(武汉430030)
关键词：肝癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期调控；流式细胞术
【摘 要】 目的：探讨肝癌发生过程中细胞周期调控下细胞增殖与凋亡的关系。方法：以二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠实验性肝癌为模型，以Ki-67抗原和Sub-G1法分别作为细胞增殖和细胞凋亡定量分析方法。凋亡细胞比例（Ap）与Ki-67阳性细胞比例（Ki）之比值（Ap/Ki）为描述两者关系的客观指标。结果：除诱癌8周和20周外，余各实验组的细胞凋亡数目与对照组相比均存在明显差异(P＜0.05)。在肝硬变前期和肝硬变期Ap与Ki基本呈正比关系。Ap/Ki于诱癌2、10、18周较高，峰值位于诱癌2周。结论：①大鼠肝癌发生过程中，机体进行细胞增殖以补偿因DEN损害导致肝细胞减少的同时，还通过细胞周期调控机制，以细胞凋亡为表现形式，始终在监测和清除着异常细胞；②肝硬变前期和肝硬变期，机体通过细胞凋亡，使组织增生的速度和规模受到控制。
中图分类号：R730.23;Q28文献标识码：A文章编号：1000-467X（1999）05-0492-03
The research into the relation between cell proliferation and apoptosis during the course of hepato carcinogenesis
WEI Wei,GONG Jian-ping,QIU Fa-zu.
Department of Surgery ＆ Molecular Medical Centrer, Shenzhen Central Hospital, Shenzhen 518036,P.R.China
【Abstract】Objective：The relation,under the regulation of cell cycle,between cell apoptosis and proliferation during the onset and development of carcinoma was studied. Methods：The model for this experiment was hepatocarcinoma induced in a rat by DEN. Sub-G1 method was used for measuring apoptosis and the findings from the testing with Ki-67 antigen were for indices of cell proliferation.Result：The results indicated that except for 8th week and the 20th week after the onset of the disease,glaring difference in total numbers of apoptosis cells(P＜0.05)existed between the experiment groups and contrast groups. In the pre-cirrhosis and cirrhosis stage,the number of apoptosis cells was basically in proportion to that of proliferating cells. The peaks of Ap/Ki was in the 2nd week.Conclusions：① All this suggested that during the hepatocarcinogenesis and the developing stage of liver cancer in a rat its organism never cease to monitor the activities of and eliminate the abnormal cells;② During the precirrhosis and cirrhosis stage,the velocity and extent of tissue proliferation was limited by cell apoptosis.
Key words： Liver cancer;Cell proliferation;Cell apoptosis;Cell cycle regulation;Flow cytometry
细胞失控性生长是恶性肿瘤所共有的特征，而细胞的分裂、生长和增殖必须经由细胞周期才能得以实现。近几年来的研究发现，绝大多数肿瘤细胞，都存在着若干细胞周期调控基因的改变〔1〕。我们以二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌为模型，对肝癌发生过程中的细胞周期调控机制进行了初探，报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物模型
雄性Wistar大鼠60只（同济医科大学实验动物中心提供），体重140～170g。随机选择5只作为正常对照，实验组以DEN水溶液(Sigma公司)每周灌胃一次。剂量：70mg/kg，15周后停药。分别在喂药后第1、2、4、6、8、10、12、14、16和18周周末，取2～4只大鼠处死，20周周末处死全部动物。
1.2 检测样本的制备
参照文献〔2〕，并做了部分简化、改良，将获取的肝脏组织制备成单细胞悬液，以-20℃、70％乙醇固定后，置于-20℃保存。
1.3 样本检测
检测前将细胞数调至5×105/ml左右，参照文献〔3〕、〔4〕，应用流式细胞仪（BD公司，USA）进行SubG1法和Ki67抗原检测，以定量分析细胞凋亡和细胞增殖。
1.4 检测结果
应用stata软件，进行方差分析和两两比较。
2 结果
表1为Ki-67抗原和Sub-G1法检测结果。同时我们以凋亡细胞比例(Ap)与Ki-67阳性细胞比例(Ki)之比值(Ap/Ki)作为描述两者关系的客观指标（表2）。结合病理所见，参考文献〔5〕，我们将整个实验过程分为：
2.1 肝硬变前期（诱癌第1～8周）
由表1看出，此期Ki值和Ap值均较高，两者基本呈正比关系。但考虑一周时DEN对肝细胞强烈、广泛地损害作用后出现的组织反应性增生和大量坏死细胞，对检测过程可能有干扰。这一阶段病理所见为：肝脏表面有细小颗粒形成，肝小叶周边可见增生的小肝细胞。
2.2 肝硬变期（诱癌第8～14周）
Ki值比4～6周时明显降低，且变化幅度不大。此期Ap平均值最低，两者仍基本呈正比关系。
2.3 癌变早期（诱癌第14～18周）
Ki值较前期增高，肝细胞又一次进入增殖活跃期。虽然此期肝脏体积缩小，但肝脏表面之增生结节却变大、增多。此期Ap平均值高于肝硬变期。
2.4 癌变演进期（诱癌第18～20周）
Ki值和Ap值均较癌变早期为低。
另由表2看出，Ap/Ki值的峰值位于诱癌第2周。诱癌10周和18周，Ap/Ki值也相对较高。根据文献〔6〕的报道：不应以Ap值而应以Ap/Ki值衡量其不同时期所具作用之份量，说明凋亡细胞在这三个时间发挥着较重要的作用。而Ap/Ki值在诱癌第6、14、20周时均较低，我们在实验过程中发现，实验中途死亡的大鼠大多发生在上述时间前后不久。图1为部分时间的Sub-G1法检测细胞凋亡结果示意图。由图中看出，正常大鼠肝细胞以4n细胞为主，14周后2n细胞开始占优势。
表1 Sub-G1法和Ki-67检测结果
|
项 目 |
对照组 |
DEN喂药后周数 |
|
1W |
2W |
4W |
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
16W |
18W |
20W |
Ap( ) |
0.33±0.31 |
16.2±1.14 |
13.56±0.68 |
15.23±1.42 |
8.52±0.69 |
5.26±0.43 |
8.09±0.14 |
6.72±0.29 |
6.97±0.18 |
15.26±0.40 |
9.35±0.79 |
5.50±0.28 |
| Ki-67
() |
0.79±0.28 |
40.50±7.64 |
15.56±3.02 |
37.32±1.41 |
28.52±2.89 |
11.28±1.09 |
14.76±2.84 |
17.71±1.61 |
27.77±2.25 |
37.24±3.60 |
14.28±0.67 |
16.48±1.07 |
表2 凋亡细胞比例与增殖细胞比例(Ap/Ki)的比值
|
项 目 |
对照组 |
DEN喂药后周数 |
|
1W |
2W |
4W |
6W |
8W |
10W |
12W |
14W |
16W |
18W |
20W |
| 比值
() |
0.42±0.04 |
0.40±0.05 |
0.87±0.14 |
0.41±0.03 |
0.30±0.01 |
0.47±0.01 |
0.55±0.08 |
0.38±0.02 |
0.25±0.02 |
0.41±0.03 |
0.65±0.03 |
0.33±0.01 |
图1 细胞凋亡检测结果示意图
3 讨论
3.1 细胞增殖情况
肝硬变前期的第4、6周，在持续的诱癌剂损害后，为弥补正常肝细胞的减少，细胞增殖活跃，以至形成病理上所见的肝表面小颗粒。整个肝硬变期，Ki值相对较低，肝脏增殖能力显著下降。癌变早期Ki值明显增高，细胞再次处于高增殖状态，但到了癌变演进期，Ki值又大幅度降低，其下降的原因可能有二：一是凋亡细胞也可有Ki-67抗原存在〔7〕，这一时期Ap值下降会影响到Ki-67值；二是Ki-67蛋白合成最多是在细胞第一次的DNA合成期〔8〕，而癌组织来自一个癌细胞的克隆。
3.2 细胞凋亡情况
由表1看出，除诱癌第8和20周外，各实验组Ap值与对照组相比均存在显著性差异(P＜0.01)，表明在肝癌发生的异常组织增生过程中，细胞凋亡基本与细胞增殖相伴随。诱癌第1、2、4和16周的Ap值均较高，但第16周时凋亡细胞多来自增生结节周围〔9〕。3.3细胞周期调控下细胞增殖与凋亡关系
细胞的生长和分裂受控于一些核心细胞周期调控因子，其中最重要的是细胞周期素依赖性蛋白激酶(Cyclin-Dependent-Kinase,CDK)及其抑制物(CDKInhibitor,CDI)。cyclins，CDKs以及CDIs，彼此间形成一个以CDKs为中心的细胞周期调控网络系统，以保障“各个细胞周期事件的启动、完成、忠实性及其按序进行”。保障的主要结构基础是细胞周期检测点(cell cycle checkpoint)。DEN可通过与DNA、RNA及许多蛋白质结合，造成DNA损害，影响RNA的转录。G1、S及G2/M期检测点，在DNA受损后，多种因子、多种途径被激活〔10,11〕，以阻止细胞进入下一时期，便于DNA复制前受损DNA得到修复和清除异常病变。
正是由于存在上述机制，在机体进行细胞增殖以补偿因DEN损害导致肝细胞减少的同时，还通过健全的细胞周期调控机制，以细胞凋亡的表现形式来清除异常细胞。综合表1.、表2，在肝硬变前期和肝硬变期，细胞增殖与凋亡基本呈正比关系，机体有效地控制着组织增生的速度和规模。与对照组相比，除第8和20周外，余实验组Ap值均有明显差异，表明机体一直在进行着清除异常细胞、阻止细胞转化的努力。Ap/Ki峰值位于诱癌第2周，提示在致癌物作用的早期，机体即通过细胞凋亡机制阻止异常细胞继续增殖和形成异常组织增生灶。但DEN对DNA的持续损害，造成众多基因、蛋白发生异常变化，如cyclinD的过表达，p53、p16基因突变，p21蛋白丢失等，使检测点阈值改变，功能下调，最终导致细胞周期调控下细胞增殖与细胞死亡之间的失衡，细胞失控性生长，发生癌变。
正常大鼠肝细胞以4n细胞为主，14周，尤其是16周后，2n细胞开始占绝对优势。说明DEN诱导的大鼠实验性肝癌，是以小肝细胞癌为主的肝细胞癌。
基金项目：国家自然科学基金项目（项目号：39670365，39725027，39730270）资助课题
〔参考文献〕
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收稿日期：1999-07-07；修回日期：1999-08-04
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