肝癌染色体DNA拷贝数的变化及其与临床病理和预后的关系
癌症 1999年第5期第18卷 快速报道
作者：王辉云 关新元 方燕 元云飞 梁启万 夏建川 邵建永 李辉梅
单位：中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤研究所(广州市,510060)
关键词：肝肿瘤；染色体；人；预后；比较基因组杂交
【摘 要】 目的：探讨人肝癌染色体DNA的丢失和增加的状态及其在肝癌临床病理及预后中的意义,并为寻找肝癌相关基因提供线索。方法：收集手术切除的肝癌标本31例，采用比较基因组杂交方法对肝癌染色体DNA拷贝数进行检测，同时进行病理观察和随访。结果：在染色体DNA拷贝数的增加中，以1q的频率最高（83.9％），其次为8q（61.3％）；在染色体DNA的拷贝数的减少中，以16q的频率最高（77.4％），其次为17p（61.3％）和4q（51.6％）。经统计分析发现，在1q拷贝数增加的病例中，其半年生存的相对机率比无1q扩增的病例高10.5倍（回归系数β=2.35，P＜0.05）；有17p丢失患者的半年内复发的相对危险性比无17p丢失的患者高6.86倍（回归系数β="1.93，"P＜0.05）。此外，1q的增加与肿瘤大小、有无包膜、坏死程度和AFP浓度等均呈负相关；4q和17p的丢失与肿瘤分化程度均呈负相关；4q的丢失与8q的增加呈负相关。这是第一次报道肝癌染色体DNA拷贝数的变化与肝癌临床、病理以及预后之间的关系。结论：在肝癌的发生发展中多个染色体的DNA拷贝数存在着高频率的变化，其中1q的增加提示肝癌的预后较好，而17p的丢失则提示肝癌的预后较差。
中图分类号：R735.7；R730.2 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)05-0509-05
The change of chromosome DNA copies is associate to clinic pathology and prognosis of hepatocellular carcinoma
WANG Hui-yun,GUAN Xin-yuan,FAN Yan,et al.
Cancer Institute, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510060, P. R. China
【Abstract】 Objective：To explore the change of copy number of chromosomal regions of hepatocellular carcinoma(HCC) and its relationship with the clinic pathology as well as the prognosis of HCC, providing the clue of cloning the key gene in HCC. Methods：Thirty-one HCC specimens obtained from surgical resection were used for detection of variation of chromosome DNA by comparative genomic hybridization. The samples also were examined pathologically and the data of follow-up were collected. Results： Among the gains of chromosome DNA copies, the highest frequency was 1q (83.9％ ), the second highest was 8q(61.3％ ); Among the losses of chromosome DNA copies, the highest frequence is 16q(77.4％ ), the followed were 17p(61.3％ ) and 4q(51.6％ ). Multiple Logistic Regression analysis showed that six month survive relative rate of patients with 1q gain was 10.5-fold higher than that of patients without 1q gain(β =2.35， P＜0.05)； the relative risk of six month recurrence of patients with 17p loss was 6.86-fold higher that of than patients without 17p loss(β="1.93，" P＜ 0.05). Correlation analysis show that the 1q gain was negatively correlative to tumor size, capsule, necrosis degree and AFP concentration. The losses of 4q and 17p were positively correlative to tumor differentiation degree. There was positive correlation between the 4q loss and 8q gain. The 4q loss was detected in most tumors originating from sixth-segment of liver and rare observed in tumors occurring in third-segment of liver. This study was the first analysis of the relationship between the change of copy number of chromosomal regions and the clinic-pathology as well as prognosis of HCC. Conclusions： The changes of copy number of chromosomal regions played important role during the development of HCC, and the 1q gain was a marker of good prognosis of HCC and 17p loss was a marker of poor prognosis of HCC.
Key words：Liver neoplasm；Chromosomes;human；Prognosis；Comparative Genome Hybridization
肿瘤的发生是一个多阶段、多遗传变异累积的过程，这一理论已被大家所公认。了解肿瘤的遗传变异对于阐明肿瘤的发生过程和癌变机理有重要作用。肿瘤细胞的遗传变异包括染色体和基因的异常。研究肿瘤细胞染色体异常的途径一是经典的细胞遗传学方法，另一途径是采用近十年迅速发展起来的分子生物学方法研究染色体上不同位点的变异。在这两类方法中，前者由于实体瘤的染色体制备困难、核型复杂不易分析而使其应用受限；后者由于仅能研究染色体少数位点的状态而难以了解染色体变异的全貌，因而使用上也受到一定的限制。1992年Kallioniemi等[1〕报道了一种崭新的研究染色体拷贝数变化的分子细胞遗传学方法,称为比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)。该方法无需制备肿瘤染色体却可研究肿瘤细胞染色体拷贝数的变异情况(包括丢失和增加)，这对于肿瘤的遗传和分子生物学研究有重要意义。最近，我们用比较基因组杂交方法对我国的原发性肝癌进行了研究并结合临床及随访资料进行了分析，以探讨遗传变异与肝癌发生发展之间的关系，同时为寻找肝癌的相关基因提供线索。
1 材料和方法
1.1 病例
顺序收集本中心肿瘤医院1996年5月至8月初诊住院病人手术切除的肝癌标本31例，其中男27例、女4例，平均年龄49.5岁(范围26岁～71岁)。同时追踪观察和收集随访资料。
1.2 病理检查
每个病例的肝癌标本经切片和HE染色后由高年资病理科医生观察记录各种病理变化。
1.3 肿瘤组织DNA的抽提
切取的瘤组织立即置液氮保存，冻硬打碎后采用常规的酚-氯仿方法抽提基因组DNA。
1.4 比较基因组杂交
基本上按Kallioniemi等[1〕报道的方法进行，稍作改进，简述如下：
1.4.1 探针制备：每个病例取1μg肝癌DNA和等量的正常人外周血单个核细胞DNA用缺口平移法分别标记fluorescein-12-dUTP和TexasRed-5-dUTP。
1.4.2 原位杂交：常规方法制备正常男性外周血淋巴细胞分裂中期的染色体；取染色体分散良好的玻片用RNA酶（100μg/ml:2×SSC）37℃处理1小时，2×SSC洗两次，再入70％甲酰胺:2×SSC溶液中，于75℃变性5分钟，最后逐级脱水、风干。分别取标记好的肿瘤DNA和正常人血细胞DNA400ng一起加入10μl杂交液（50％甲酰胺:2×SSC:10％硫酸葡聚糖:5μgCot1DNA）,于75℃变性5分钟、37℃复性30分钟，然后将其加在已处理好的含染色体的玻片上，盖上盖玻片并予以封闭，于37℃杂交48小时。杂交后分别入0.4×SSC:0.3％Tween20于75℃漂洗2分钟共3次、2×SSC:0.1％Tween20于室温中洗3次，风干后用DAPI复染。
1.4.3 数字图象分析：杂交后的玻片置于NikonSA表荧光显微镜下观察，显微镜配有CCD摄像头并连接到SUN工作站。每个杂交的染色体上显现的绿色荧光（肿瘤DNA）和红色荧光（正常细胞DNA）经工作站处理后给出两种荧光的比率及其分析图。当绿红荧光比率大于1.20时定为肿瘤染色体DNA拷贝数增加1个，若大于1.4则定为扩增；当绿红荧光比率少于0.80时定为肿瘤染色体DNA丢失1个拷贝。每个病例分析5个以上高质量的杂交核型，综合分析后得出每个染色体DNA变化的结果。
1.5 统计分析
所有数据均经SPSS统计软件包整理和分析。采用列联表分析法统计处理各染色体拷贝数变化与临床资料、病理观察指标之间的关系；用多元Logistic回归分析统计处理各染色体拷贝数变化与随访资料（包括死亡和复发）之间的关系。
2 结果
2.1 肝癌染色体DNA拷贝数的变化
用CGH共检测了31例肝癌组织，全部病例均有染色体DNA拷贝数的增加，其中18例存在染色体DNA拷贝数的扩增；30个病例存在染色体DNA拷贝数的丢失；每个病例平均存在9.8（范围1～19）条染色体变异，其中每个病例平均存在4.4（范围0～10）条染色体DNA拷贝数的丢失、5.5（范围1～10）条染色体DNA拷贝数的增加（包括扩增）。以变异所涉及的具体染色体来看，24条染色体均有涉及，其中20条染色体既有DNA拷贝数的增加又有丢失，14号、16号和21号等3条染色体只有DNA拷贝数的丢失而无增加，7号染色体只有增加而无丢失。在高频率变异的染色体中，83.9％（26/31）的病例存在1qDNA拷贝数的增加，其中5例为扩增；61.3％（19/31）的病例存在8q的增加、35.5％(11/31)存在7q的增加；77.4％（24/31）的病例存在16qDNA拷贝数的丢失，61.3％（19/31）存在17p的丢失、51.6％（16/31）存在4q的丢失，具体详情见图1。
图1 CGH检测31例肝癌DNA变异频率结果图.
染色体左侧的线条表示DNA丢失的范围;右侧的线条表示DNA增加的范围,粗线条表示扩增.
2.2 染色体变异与临床、病理及预后的关系
将高频率变异的染色体1q、4q、8q、16和17p等与病人的年龄、性别、肿瘤的分化程度、肝硬化、肿瘤大小、有无包膜、有无癌栓、炎症、坏死、肿瘤发生的部位、血清中的HBsAg、HCV、AFP、谷丙转氨酶、γ谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶等进行了相关和卡方分析，现将有相关性和卡方分析有显著性意义的主要结果总结于表1中。统计分析还发现，4q的丢失与8q的扩增成负相关（r=-0.37，P＜0.05）；4q的丢失多见于第VI段肝的肿瘤，而少见于第III段肝肿瘤，17p的丢失多见于第四段肝肿瘤。同时我们将这几个高频率变异的染色体与随访资料进行了多元Logistic回归模型分析，结果发现有1q扩增的患者比无1q扩增的患者的半年生存机率大10.5倍（回归系数β="2.35，"P＜0.05）；有17p丢失的患者比无17p丢失的患者的半年复发机率大6.86倍（回归系数β="1.93，"P＜0.05）。
3 讨论
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在我国十大恶性肿瘤的排名中已从第三位上升到第二位[2〕，严重地危害着人们的身体健康。因此，加强肝癌的防治研究具有重要意义。本次实验采用近年国外发展起来的比较基因组杂交（CGH）技术研究肝癌染色体拷贝数的变异，发现所有病例的染色体均有变异，而且变异涉及到24条染色体，每个病例平均存在9.8条染色体异常，与我们曾报道的用直接法制备染色体进行研究的结果相似[3〕。在高频率变异的染色体中，变异频率＞50％的染色体有1q、4q、8q、16q和17p，其中17p的丢失与我们以前报道的80％的病例存在17p缺失的结果相似[3〕。最近法国学者Marchio等[4〕也报道了用CGH研究肝癌染色体DNA拷贝数的变异。在他们的研究结果中，变异频率高达50％以上的染色体有：1q和8q的增加分别为58％和60％，4q的丢失为70％，8p为65％，16q为54％，17p为51％[4〕。由此可见，除了8p以外，Marchio的结果与我们的结果基本上互为印证，提示在1q和8q两个染色体部位可能存在着与肝癌密切相关的癌基因位点，在16q、17p和4q三个部位可能存在着与肝癌密切相关的抑癌基因位点。然而，Marchio等没有分析肝癌染色体的变异与临床病理及预后的关系。
表1 肝癌染色体DNA拷贝数与临床、病理和预后之间关系的结果
|
项目 |
例数
n |
Iq扩增
n(％) |
4q丢失
n(％) |
8q扩增
n(％) |
16q丢失
n(％) |
17p丢失
n(％) |
| 性别 |
|
|
|
|
|
|
|
男 |
27 |
22(81.5) |
13(48.1) |
18(66.7) |
22(81.5) |
19(70.4)＊ |
|
女 |
4 |
3(75.0) |
3(75.0) |
1(25.0) |
(50.0) |
0(0.0)＊ |
| 年龄 |
|
|
|
|
|
|
|
〈50y |
16 |
12(75.0) |
10(62.5) |
10(62.5) |
9(56.3)＊ |
9(56.3) |
|
〉50y |
15 |
13(86.7) |
6(40.0) |
9(60.0) |
15(100)＊ |
10(66.7) |
| 分化程度 |
|
|
|
|
|
|
|
高 |
10 |
9(90.0) |
2(20.0)＊ |
7(70.0) |
7(70.0) |
3(30.0)＊ |
|
中 |
17 |
12(70.6) |
11(64.7)＊ |
10(58.8) |
14(82.4) |
13(76.5)＊ |
|
低 |
4 |
4(100) |
3(75.0)＊ |
2(50.0) |
3(75.0) |
3(75.0)＊ |
| 肿瘤大小 |
|
|
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|
〈5cm |
12 |
11(91.7)＊ |
6(50.0) |
4(33.3) |
9(75.0) |
6(50.0) |
|
5～10cm |
11 |
10(90.9)＊ |
5(45.5) |
11(100) |
8(72.7) |
9(81.8) |
|
〉10cm |
8 |
4(50.0)＊ |
5(62.5) |
4(50.0) |
7(87.5) |
4(50.0) |
| 肿瘤包膜 |
|
|
|
|
|
|
|
有 |
17 |
11(64.7)＊ |
8(47.1) |
10(58.8) |
13(76.5) |
12(70.6) |
|
无 |
11 |
11(100)＊ |
6(54.5) |
7(63.6) |
9(81.8) |
6(54.5) |
| 肿瘤坏死 |
|
|
|
|
|
|
|
无 |
11 |
10(90.9)＊ |
5(45.5) |
8(72.7) |
9(81.8) |
6(54.5) |
|
轻 |
12 |
11(91.7)＊ |
6(50.0) |
5(41.7) |
9(75.0) |
8(66.7) |
|
重 |
6 |
2(33.3)＊ |
4(66.7) |
5(83.3) |
4(66.7) |
4(66.7) |
| HBsAg |
|
|
|
|
|
|
|
阳性 |
23 |
18(78.3) |
12(52.2) |
13(56.6) |
16(69.6) |
15(65.2) |
|
阴性 |
4 |
3(75.0) |
3(75.9) |
3(75.0) |
4(100) |
3(75.0) |
| AFP浓度 |
|
|
|
|
|
|
|
＜25ng/ml10 |
10 |
10(100)＊ |
3(30.0) |
7(70.0) |
6(60.0) |
6(60.0) |
|
＞25ng/ml |
17 |
12(70.6)＊ |
11(64.7) |
9(52.9) |
15(88.2) |
11(64.7) |
| 半年内复发 |
|
|
|
|
|
|
|
有 |
14 |
11(78.6) |
6(42.9) |
9(64.3) |
11(78.6) |
12(85.7)＊ |
|
无 |
15 |
13(86.7) |
8(53.3) |
8(53.3) |
10(66.7) |
7(46.7)＊ |
| 生存半年以上 |
|
|
|
|
|
|
|
是 |
22 |
20(90.9)＊ |
10(45.5) |
14(63.6) |
17(73.3) |
13(59.1) |
|
否 |
9 |
5(55.6)＊ |
6(66.7) |
5(55.6) |
7(77.8) |
6(66.7) |
＊表示两者或三者之间的差异有统计学意义，P＜0.05或P＜ 0.01
近年来，除了CGH用于肿瘤染色体DNA拷贝数变异的研究外，采用PCR方法研究肿瘤染色体等位基因杂合性丢失（Loss of heterozygosity,LOH）的报道很多。如Piao等[5〕报道用68个微卫星（microsatellite）标志的引物进行PCR检测肝癌染色体LOH，结果发现LOH频率高于30％的染色体长短臂共有9个，其中4q为72.7％、16q为59.1％、17p为46.2％；法国学者Bioge等[6〕报道用275个微卫星标志检测肝癌染色体位点LOH，发现LOH频率≥29％的染色体长短臂也是9个，其中4q为42％、16q为39％、17p为48％。这些结果与本次实验检出4q、16q和17pDNA拷贝数丢失的频率相似，强烈提示这些染色体位点存在着与肝癌相关的抑癌基因。
将染色体DNA拷贝数的变异与肝癌临床、病理资料结合进行相关和卡方分析，发现1q的扩增与肿瘤大小成负相关（χ2=6.49,r=-0.39,P＜0.05），提示1q的扩增可能与肝癌的发生有关。此外，1q的扩增尚与肿瘤有无包膜和坏死程度以及AFP浓度均成负相关，全部P＜0.05。4q的丢失与肝癌的分化程度成负相关（χ2="6.04, "r="-"0.41,P＜0.05），提示4q丢失可能与肝癌的进展恶化有关。16q的丢失多见于年龄较大的肝癌患者（χ2="8.48,"r="0.52,"P＜0.01）,50岁以上的患者全部都有16q的丢失。17p的丢失与肝癌的分化程度也成负相关（χ2="6.09,"r="-"0.38,P＜0.05），提示17p的丢失可能与肝癌的进展恶化有关。此外，17p的丢失只发生在男性肝癌患者（χ2="7.27,"r="0.48,"P＜0.01），提示17p的丢失可能还与性别有关。由此可见，肝癌染色体DNA拷贝数的变异与其临床特征和病理变化密切相关。
在与随访资料的多元Logistic回归分析中，发现有17p丢失病例的半年复发的相对危险性比无17p丢失病例高6.86倍。由于17p上存在着抑癌基因p53，因此，本实验中17p的丢失可能导致p53等位基因的缺失。Hsu等〔7〕的报道表明，肝癌中p53基因的突变和mRNA表达减少与病人的生存率密切相关。因此，肝癌病人的复发可能与p53的缺失有关，但17p的丢失绝大部分是整个短臂的丢失，这提示除p53以外可能还涉及到其他尚未知晓的抑癌基因的缺失。这是一个值得探讨的问题。
在多元Logistic回归分析中，还存在着一个令人感兴趣的现象：1q染色体DNA拷贝数的增加使病人的半年生存机率提高，也就是说，1q的增加预示着肝癌病人的预后较好、是一个预后好的指标。一般认为，肿瘤染色体丢失的部位可能含有相关抑癌基因，而增加的部位可能存在相关的癌基因。然而，根据本次研究结果，我们认为在染色体扩增的部位也可能存在着具有对抗癌基因产物作用或具有阻抗肿瘤进展作用的基因，这样，尽管可能有癌基因的扩增，但由于也同时存在具有抗肿瘤作用的基因扩增、甚至其作用更强，使肿瘤的恶性程度得到遏制。因此，1q染色体拷贝数增加的病人的预后比无1q染色体拷贝数增加的病人好。最近，Hansen等〔8〕报道16q23.2-24.2的等位基因丢失是原发性乳腺癌预后好的一个独立标志。他们认为，16q染色体的丢失不仅丢失了抑癌基因、同时可能也丢失了促进肿瘤恶化进展或引起肿瘤转移的“癌基因"，因此，有16q染色体丢失的病人比无16q丢失的病人的预后好。根据上述我们以及Hansen等的实验结果，我们认为，肿瘤细胞染色体的扩增不仅导致癌基因的扩增、同时也可能使肿瘤的“抑癌基因"扩增，而肿瘤染色体的丢失不仅丢失了抑癌基因、可能同时也丢失了“癌”基因。这一假设若能被进一步的证实，将对肿瘤分子遗传学的研究产生重要的影响。
基金项目：国家自然科学基金项目(批准号39670814)资助
Cancer Genetics Branch,National Human Genome Research Institute,National Institutes of Health，USA.
〔参考文献〕
〔1〕 Kallioniemi A,Kallioniemi OP,Sudar D,et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors〔J〕. Science,1992,258:818～821.
〔2〕 李连弟，鲁凤珠，张思维,等.中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析〔J〕.中华肿瘤杂志，1997,19：3～9.
〔3〕 方燕,李国辉,卓子兰.20例原发性肝癌实体瘤的细胞遗传学研究〔J〕.中国优生与遗传杂志，1996，4：34～37.
〔4〕 Marchio A,Meddeb M,PineauP,et al. Recurrent Chromosomal Abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization〔J〕. Gene Chromosomes ＆ cancer,1997,18:59～63.
〔5〕 Piao Z,Park C,Park JH,et al. Allelotype analysis of hepatocellular carcinoma〔J〕. IntJCancer,1998,75:29～33.
〔6〕 Bioge V,Laurent-Puig P,FouchetP,et al. Concerted nonsyntenic allelic losses in hyperploid hepatocellularcar cinoma as determined by high-resolution allelotype〔J〕. CancerRes,1997,57:1986～1990.
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〔8〕 Hansen LL,Yilmaz M,Overgaard J,et al. Allelic loss of 16q23.2-24. 2 is an independent marker of good prognosis in primary breast cancer〔J〕. CancerRes,1998,58:2166～2169.
收稿日期：1999-06-23;修回日期：1999-07-25
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