EGF对肝癌细胞及正常肝细胞内ras基因表达的影响

癌症 2000年第6期第19卷 基础研究

作者：赵国强　许红雨　胡瑞德　钟觉民　董郡

单位：赵国强　许红雨　胡瑞德　钟觉民　董郡（中山医科大学病理学教研室,广东广州510080）

关键词：表皮生长因子；Ras基因；肝癌细胞株

　　【摘要】目的：揭示正常肝细胞和肝癌细胞对表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)不同的应答能力，以及EGF对两种不同细胞株内ras基因表达的影响。方法：运用Western免疫印迹技术对正常肝细胞株L－02和肝癌细胞株Hep－G2中p21^ras的表达进行比较分析。结果：在两种细胞株L－02和Hep－G2中都检测到p21^ras的表达。Hep－G2细胞的p21^ras表达量在EGF刺激前明显高于L－02细胞，经EGF刺激2周后，p21^ras的表达量持续攀升，表达曲线陡峭。而L－02在EGF刺激下上升得比较缓慢，到第4周以后基本维持恒定的表达量。结论：正常肝细胞和肝癌细胞内ras基因的表达都受EGF的影响，但二者对EGF的应答能力明显不同。肝癌细胞内ras基因的高表达可能与细胞内缺乏有效的反馈机制有关，而ras基因的表达持续升高可能是导致细胞增殖失控的一个重要原因。

　　中图分类号：R735.7　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X（2000）06－0524－03

Effects of EGF on ras expression in both normal liver cells

　　and hepatoma cells

ZHAO Guo－qiang, XU Hong－yu, HU Rui－de, et al.

　　Department of Pathology,Sun Yat－sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080,P.R.China

　　【 Abstract】 Objective: To reveal the different responsive ability to epidermal growth factor(EGF) between normal liver cells and hepatoma cells, and the effects of EGF on ras gene expression in these cell lines. Methods: Western blot analysis was used to analyze the expression of p21^ras in normal liver cell line L－02 and hepatoma cell line Hep－G2. Results: The expression of p21^ras has been detected in both cell lines and image analysis showed that the p21^ras level in Hep－G2 cell was higher than that in L－02 cell before EGF stimulation. After 2 weeks of EGF stimulation, p21^ras expression in Hep－G2 cell continually increased and the expression curve was steep, while the increase of p21^ras was slower in L－02 cell and the expression level reach plateau after 4 weeks of stimulation. Conclusion: Both in normal liver cells and hepatoma cells the expression of ras gene can be effected by EGF. But the responsive ability to EGF is different between the two cell lines.The higher expression level of ras gene in hepatoma cells is perhaps relevant to lack of an efficacious feedback in the cells. The continuous increase of ras gene expression might be an important reason leading to the loss of control of cell proliferation.

　　Key words: Epidermal growth factor; Ras gene; Hepatoma cell line

　　细胞的癌变是一个复杂的生物学过程，这一过程受多种因素的影响，包括原癌基因的激活及相关信号传导通路的异常。p21^ras是原癌基因ras的产物，它是一种GTP结合蛋白，是信号传导通路中一个十分重要的介导分子。p21^ras在正常的细胞增殖过程中起着极为重要的作用，其基因结构的改变（如突变）及表达的异常，都有可能打破细胞生长的正常程序，引起肿瘤的发生。表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是肝细胞的主要分裂原，它不仅促进多种组织来源细胞的增殖，还影响组织器官的分化，且与创伤愈合、内分泌的调节密切相关。近年的研究表明，EGF与某些肿瘤的发生发展密不可分。

　　本研究运用Western免疫印迹技术通过对正常肝细胞株L-02和肝癌细胞株Hep-G2中p21^ras的表达进行比较分析，以揭示正常肝细胞和肝癌细胞对EGF不同的应答能力，以及EGF对两种不同细胞株内ras基因表达的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1细胞培养

　　正常肝细胞株（L-02）及肝癌细胞株（Hep-G2）由中科院上海细胞生物学研究所提供。两种细胞株均在标准条件下常规体外培养〔培养液为RPMI1640（Gibco）＋20％血清＋双抗（100u/ml）〕。每株细胞分为两组：⑴实验组培养液含有20ng/ml的EGF(Sigma);⑵对照组培养液不含EGF。EGF的刺激时间分别为2、4、8、10和12周。

　　1.2Western免疫印迹

　　1.2.1样品的制备:将培养一定时间的受检细胞常规胰酶消化，用预冷的PBS漂洗2次，加入预冷的细胞裂解液[250mmol/L蔗糖，20mmol/LTris-HCl(pH7.5)，100mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，50mmol/LKCl，1mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，1％NP-40]，置于0℃30分钟，离心10分钟（12000r/min，4℃），取上清保存于－20℃或－70℃。

　　1.2.2蛋白质浓度的测定:采用考马斯亮蓝G－250染色法进行蛋白质定量。

　　1.2.3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）:使用Mini-ProteinⅡ（Bio-Rad）进行电泳（线性梯度胶5％～20％，积层胶4％，200V，0.8h）。

　　1.2.4电转移:电泳后，使用半干电转移仪（Bio-Rad）将样品转移到尼龙膜。

　　1.2.5CSPD显示:免疫染色采用LSAB法。将携有样品的尼龙膜依次入PBS5分钟，封闭液30分钟，加抗体p21ras(DAKO)孵育一小时（1∶250），尼龙膜入PBS洗3次10分钟，加二抗（马抗鼠IgG）孵育1小时，尼龙膜入PBS洗3次10分钟，加LSAB孵育1小时，PBS洗3次10分钟，CSPD孵育10分钟，X-片曝光，暗房显影。

表1　ras蛋白表达曲线（平均光密度）

　　1.3　结果分析

　　用图像分析仪(KontronIBASS2.0)处理分析结果。2　结果

　　Western印迹分析的结果显示，在21KD处可见一特异性条带（图1）。图像分析得出的各样本p21^ras蛋白相对含量如表1所示。在EGF-影响下，两种不同细胞株内p21^ras蛋白的表达曲线如图2所示。由以上数据可以看出，在EGF刺激前Hep-G2细胞的p21^ras蛋白表达量明显高于L-02。EGF刺激2周后，p21^ras蛋白的表达量持续攀升，表达曲线陡峭。而L-02在EGF刺激下上升得比较缓慢，到第4周以后基本维持恒定的表达量。

图1p21^ras蛋白Western免疫印迹分析

　　Ap21^ras蛋白在Hep-G2细胞内的表达;

　　Bp21^ras蛋白在L-02细胞内的表达。

　　H:Hep-G2细胞;L:L-02细胞;

　　A431:人表皮样癌细胞(对照)

图2　Ras蛋白表达曲线

　　3　讨论

　　EGF作为肝细胞的主要致分裂原，与肿瘤的发生发展密切相关^[1]。EGF的生物学效应是通过与细胞表面的表皮生长因子受体(EGF-R)相互作用来实现的。人的EGF-R是一跨膜糖蛋白，其胞内区具有酪氨酸激酶的活性。EGF-R与其配体EGF结合后，可激活其胞内区酪氨酸激酶的活性，首先使受体自身磷酸化，继而又催化其下游靶蛋白的磷酸化，从而将细胞外信号传导入细胞内^[2,8]。p21^ras是EGF-R介导的信号传导通路中的一个关键分子，起着“分子开关”的作用^[3,4]。p21^ras的激活可引发一系列的蛋白质磷酸化级联反应（cascade），将来自上游的信号经过放大、传递到细胞核内，激活相应的核转录因子，启动相关基因的表达^[5，6，8]。由此可见，在EGF-R介导的信号传递过程中，p21^ras处于一个十分重要的地位。本研究结果显示，在相同的实验条件（刺激强度、刺激时间）下Hep-G2和L-02对EGF的应答反应明显不同。在EGF刺激的前4周，L-02细胞内p21^ras蛋白的表达量随着刺激时间的延长而缓慢增加。自4周以后，其表达量基本不变，稳定在一个恒定的水平上，表达曲线呈一平缓的直线。Hep-G2的反应与L-02明显不同，细胞在刺激的前2周似乎对EGF没有反应，p21^ras蛋白的表达处于一个相对静止期。从第2周开始，p21^ras蛋白的表达量随着刺激时间的延长逐渐攀升，表达曲线呈一陡峭的曲线。到EGF刺激的第12周，L-02细胞p21^ras蛋白的表达量是刺激前的3倍多，而Hep-G2细胞的表达量则是刺激前的近6倍。在刺激前，Hep-G2细胞p21^ras蛋白的表达量是L-02细胞的4倍多，到了第12周，Hep-G2的表达量则为L-02近8倍。由这些实验数据可以看出，正常肝细胞L-02对于EGF的刺激似乎存在一种自动反馈机制。当p21^ras蛋白的表达在EGF的刺激下达到一定的量时，这种反馈机制便启动，使p21^ras的表达量维持在一个相对恒定的水平；而肝细胞癌Hep-G2好像缺乏相应的反馈机制，对EGF的刺激经过2周的反应迟钝期后，p21^ras蛋白的表达量迅速攀升，到12周时达到刺激前的6倍。由此可以推测，ras基因的表达异常可能是造成细胞增殖失控，导致癌变的重要原因。肝癌细胞与正常肝细胞之间存在的生物学特性的差异很可能与ras基因对致分裂因子（如EGF）应答能力的差异有关。

　　以往人们对ras基因与癌变的关系有很多的研究，但这些研究更多地集中在对其基因结构的异常改变方面（如点突变）^[7，9]。本研究的结果表明，除了ras基因的结构异常改变外，其表达强度的异常也是导致癌变的重要原因。实验结果表明，正常肝细胞和肝癌细胞内ras基因的表达都受EGF的影响，但二者对EGF的应答能力明显不同。在正常肝细胞似乎存在一种反馈机制，当ras基因的表达在EGF的影响下升到一定程度时，即达到一个相对恒定的表达水平；而在肝癌细胞则好像缺乏这种反馈机制，ras基因的表达持续升高。这种ras基因的过表达可能是导致细胞增殖失控的一个重要原因。

　　基金项目：本课题由国家自然科学基金（No：39570348）资助

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收稿日期：1999－11－29；修回日期：1999－12－17